nell1基因直接体内转染修复犬下颌骨的缺损

【摘要】  目的: 探讨含Nell?1基因逆转录病毒液与聚羟基丁酸酯(PLGA)生物材料复合后修复犬下颌骨缺损的效果. 方法: 制备含Nell?1真核细胞表达载体的逆转录病毒液PT?PLNCX2?Nell?1. 制备比格犬下颌骨15 mm×10 mm×5 mm的箱状缺损模型，修复实验分为2组：PT?PLNCX2?Nell?1+PLGA修复组（实验组）， PLGA修复组（对照组）, 每组8个样本, 分别于术后8，16 wk进行大体观察、X线检测和组织学检测. 结果: PT?PLNCX2?Nell?1重组病毒液与生物材料复合修复组可见在骨缺损处有骨性连接形成，骨缺损修复，组织学观察见有大量新生骨组织形成； PLGA修复组未见骨性连接形成，仅在部分骨缺损两断段形成少量骨组织. 结论: 利用Nell?1基因体内局部、直接转移的方法能够用于犬下颌骨缺损的修复.

【关键词】  Nell?1基因；骨缺损；基因转染

　　0引言

　　近年来基因转移技术在骨组织再生、骨缺损研究中的作用越来越受到重视，将相关生长因子通过体外转移或体内直接转移的方法能够新生骨组织. Nell?1是一种具有较强成骨活性的生长因子，其成骨能力已得到证实［1］. 用逆转录病毒介导的方法可以将Nell?1蛋白转入犬骨髓间充质干细胞(BMSc)中，在获得外源Nell?1表达的同时，BMSc的成骨活性也得到显著提高. 但含有Nell?1基因的逆转录病毒液在体内是否具有诱导成骨活性、其形成骨组织并修复骨缺损的能力仍需验证.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　比格犬为广东省医药研究所提供；逆转录病毒基因载体转移系统试剂盒：包括PLNCX2逆转录病毒载体、PT67包装细等（Clontech，美国）；限制性内切酶：Sal I Sma I（New England Biolab，美国）.

　　1.2方法

　　1.2.1Nell?1逆转录病毒液的制备

　　使用Sal I酶切PB?SK?Nell?1 (American Tisue Culture Collection)和PLNCX2逆转录病毒载体(Clontech)，黏端连接后提取质粒进行酶切鉴定(Sma I酶切)，筛选出正确插入的重组质粒PLNCX2?Nell?1. 使用脂质体转染PLNCX2?Nell?1包装细胞PT67，使用G418筛选至阳性克隆形成，将阳性克隆细胞进行扩增，收集培养上清液，命名为PT?PLNCX2-?Nell?1病毒液.

　　1.2.2生物材料的制备

　　聚羟基丁酸酯(PLGA)生物材料由院化学研究所制备并惠赠. 材料呈多孔块状，参数基本如下：孔径为200~300 nm，孔隙率大于90％，将生物材料修剪成体积为0.2 cm×0.2 cm×1.5 cm长条状. 使用750 mL/L乙醇浸泡，无菌0.1 mol/L PBS反复冲洗并浸泡后，紫外线下晾干，封装备用. 用于骨缺损修复实验前取1 mL PLNCX2-?Nell?1病毒液浸泡生物材料24 h. 单纯材料修复组用相应细胞培养基浸泡.

　　1.2.3犬下颌骨缺损修复

　　实验动物选择健康比格犬8只，雌雄不拘, 体质量13～15 kg, 年龄1~1.2岁，适应性饲养2 wk. 按自身同期对照研究的设计原则，在犬下颌骨上设计两个15 mm×10 mm×5 mm的全层箱状缺损，在其中一个植入相应大小的PT?PLNCX2?Nell?1＋ PLGA复合材料，另一侧植入单纯PLGA作为对照. 实验方法：以846合剂和氯胺酮1∶1混合后，按混合液中846合剂的0.12~0.15 mg/kg肌肉注射. 用金刚砂切片切开骨皮质，用牙科台式电钻于犬下颌骨下缘中份骨皮质上造成两个长15 mm，宽10 mm，深5~6 mm的箱状缺损，术中应避免伤及下颌神经血管束，保留骨膜，在其中一个缺损内放入相应大小的PT?PLNCX2?Nell?1＋ PLGA复合材料，另一缺损植入单纯PLGA，分层缝合创口. 术后肌注青霉素80万U，庆大霉素4万U，2次/d，4 d，预防感染. 术后分笼常规饲养.

　　1.2.4检测方法

　　大体形态观察：术后8，16 wk取骨缺损修复标本进行大体观察，观察骨缺损部位骨组织再生情况、修复程度以及有无炎症反应. X线观察：分别于8，16 wk进行X线检测，观察各组骨缺损区骨痂生长和骨连接情况. 组织学切片观察：标本经40 g/L多聚甲醛固定后EDTA脱钙，石蜡包埋、切片，常规HE染色，显微镜下观察.

　　2结果

　　2．1动物一般情况

　　动物术后2 h内苏醒，1 wk内均恢复正常饮食，术后3~7 d术区局部组织肿胀明显，2 wk后伤口逐渐愈合，肿胀也逐渐消失，仅缝线处有轻微红肿，缝线1~2 mo后部分自行脱落. 未观察到动物机体的明显排斥反应和材料的裸露.

　　2．2大体观察

　　术后8 wk时，各组缺损区内均有纤维结缔组织和血管长入，试验组修复区域中心区材料表面和骨缺损两断端均可见骨样组织出现，质地较硬，对照组仅在在缺损区两断端有少量骨样组织形成. 术后16 wk时，试验组修复区域可见明显骨桥形成连接于骨缺损两断端．出现骨性愈合. 对照组在缺损区两端骨组织量相应增加，但缺损区大部仍为结缔组织填充，未出现骨性连接，骨缺损未得到有效修复.

　　2．3X线观察

　　术后8 wk实验组骨缺损两端骨端和骨缺损中心区域可见有密度增高影，呈絮状或条索状，新生骨组织桥接骨缺损，形状较为规则，髓腔未通. 16 wk时骨性愈合，骨皮质光滑连续，骨髓腔再通（图1，2）. 对照组在各时间点骨缺损界限清晰 骨缺损两端少量新生骨组织形成，骨缺损未被修复，16 wk时其形状由‘┏┓’变为‘╭╮’(图1，2).

　　2．4组织学观察试验组

　　术后8 wk可见材料表面及内部有结缔组织和小血管长入，在材料周边及内部孔隙内，有大量软骨细咆形成并向成骨细胞移行. 并形成大量致密的不规则类骨质. 部分区域可见骨小粱形成、出现骨陷窝结构，16 wk时骨细胞成熟，形成板状骨结构. 新生骨与缺损两断端连接，骨缺损修复(图3A). 对照组仅在缺损断端有少量骨痂形成，缺损中心区域未见骨组织形成，骨缺损未被修复（图3B）.

　　3讨论

　　Nell?1是在颅缝早闭患者过早闭合的骨缝连接处发现的一种分泌蛋白［2］，美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）的研究者们发现， Nell?1诱导成骨细胞分化和骨形成的能力要优于BMP［3］. Nell?1的成骨活性已在动物试验中得到证实，Nell?1复合生物材料可促进大鼠颅骨缺损的修复［4］.

　　本实验中采用含Nell?1的逆转录病毒载体直接转移的方法能够修复比格犬下颌骨15 mm×10 mm×5 mm的箱状缺损，根据X线和组织学切片的结果，采用本方法在体内诱导成骨的过程表现为较为典型的软骨内成骨过程. 在成骨的早期出现血管组织和软骨细胞，随着时间的推移，软骨细胞团的内部和周边开始出现成骨细胞，并形成少量编织骨结构，进而形成典型的板层骨结构，并有不规则的大量骨髓腔形成，其内可见较多的骨髓细胞.

　　将含nell?1基因的逆转录病毒置入骨缺损区后，病毒液感染邻近肌肉组织内的肌细胞和骨缺损两断端骨髓腔内的间充质细胞，使合成表达外源性Nell?1，进而诱导周边的间充质细胞分化成软骨细胞，通过软骨内成骨方式形成成熟的骨组织.
　　将nell?1基因置入体内可以采用直接注射或与生物材料复合后植入的方法. 直接注射的方法简便易行，但考虑到临床实际骨缺损部位大多为疤痕或大量结缔组织填充或包绕，很难完全体现Nell?1基因转染的效果. 而将Nell?1基因与相应的生物材料复合后，通过外科手术的方法清除骨缺损区的疤痕组织再植入，应能取得较好效果，同时生物材料也能为成骨细胞生长及骨组织的新生提供支架作用，更有利于新生骨组织的形成.

　　我们应用的PLGA孔径为200～300 pm，孔隙率大于90%，动物体内实验结果表明此种生物材料与PLNCX2 –Nell?1病毒液复合后能够形成新生骨组织. 虽然有报道认为PLGA材料存在一定的无菌性炎症反应问题，但在本实验中仅观察到少量的炎性细胞浸润，对骨组织的新生没有明显影响.

　　从理论上讲，将含有外源Nell?1基因的病毒载体直接用于体内局部时有可能出现过量异位成骨或体内致瘤性的问题. 逆转录病毒载体虽然具有高效准确地整合到细胞基因组上的优势，但这种整合作用又是随机的，由于病毒的LTR中含有增强子等调控序列，有可能激活原癌基因或阻断肿瘤抑制基因，并且在产生目的病毒(非复制型逆转录病毒)的同时亦有可能产生野生型病毒(可复制型病毒)，导致肿瘤的发生［5?6］.

　　我们观察到16 wk时在骨缺损修复区组织学检查未见肿瘤样组织出现，初步表明采用此种方法制备的此种滴度的病毒液中可能并不含有野生型病毒. 但还需要进一步要进行PCR, 裸鼠体内种植等实验进一步进行检测.

【】
  　　［1］Cowan CM, Cheng S, Ting K, et al. Nell?1 induced bone formation within the distracted intermaxillary suture ［J］. Bone,2006,38(1):48-58.

　　［2］Ting K, Vastardis H, Mulliken JB, et al. Human NELL?1 expressed in unilateral coronal synostosis ［J］. J Bone Miner Res,1999,14(1):80-89.

　　［3］Zhang X, Kuroda S, Carpenter D, et al. Craniosynostosis in transgenic mice overexpressing Nell?1 ［J］. J Clin Invest,2002,110(6):861-870.

　　［4］Aghaloo T, Cowan CM, Chou YF, et al. Nell?1?induced bone regeneration in calvarial defects ［J］. Am J Pathol,2006,169(3):903-915.