肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2+］i 变化及其机制探讨

【摘要】  目的：研究肺纤维化(PF)大鼠肺微血管内皮细胞内的Ca2+变化，探讨其在PF中的作用机制. 方法：SD大鼠20只，随机分为PF组和对照组，每组10只动物，按5 mg/kg体质量分别气管滴注博莱霉素及等量生理盐水，取外周肺组织原代培养肺微血管内皮细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内［Ca2+］i及中电导钙激活钾通道蛋白1（IKca1）表达，机图像分析免疫细胞化学法IKca1的表达. 结果： 激光扫描共聚焦显微镜检测PMVECs内［Ca2+］i：PF组为（166.56±24.17）明显高于对照组（95.79±13.51），两组比较差异具有统计学意义（P<0.01). 间接免疫荧光法检测IKca1表达：PF组为（679.29±206.98）明显低于对照组（958.75±188.84），两组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；免疫细胞化学检测IKca1表达：PF组（169.08±14.81）明显低于对照组（189.78±13.73），两组比较差异具有统计学意义(P<0.01). 结论：PF时，肺微血管内皮细胞［Ca2+］i过载，其发生机制可能与IKca活性异常有关.

【关键词】  肺纤维化；肺微血管内皮细胞；［Ca2+］i；中电导钙激活钾通道蛋白1

　　0引言

　　近年来对肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）发病机制的研究主要集中于多种细胞及细胞因子的相互作用等方面［1］. 但有关肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs） 在PF中作用的研究报道甚少. 中电导钙激活钾通道（intermediate conductance Ca2+?activated potassium channel，IKca）对PMVECs膜电位的稳定和细胞内［Ca2+］i 的调节具有重要作用［2］. 博莱霉素（bleomycin，BLM）对组织的损伤具有持续性［3］.我们采用BLM建立大鼠PF模型，利用细胞培养，激光共聚焦技术检测PF时PMVECs内［Ca2+］i的变化，同时检测原代培养PMVECs的中电导钙激活钾通道蛋白质1（intermediate conductance Ca2+?activated potassium channel protein 1，IKca1）表达，以期探讨PMVECs在PF发病机制中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　SD大鼠20只，体质量(150±20) g，雌雄不拘（第四军医大学实验动物中心）；BLMA5粉剂（8 mg/支，批号041103，天津太河制药）；DMEM培养基、胰酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物制品研究所）；兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体（北京中山生物试剂公司）；Fura?3/AM（美国Molecular Probe公司）； 兔抗IKca多克隆抗体， FITC?羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）； IX?70型激光共聚焦扫描仪、 光学显微镜、 倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1PF模型的建立

　　将大鼠随机分为对照组和PF组，每组各10只. BLMA5用生理盐水稀释成4 g/L，按5 mg/kg体质量气管内滴入0.15~0.2 mL.对照组气管内滴入等量生理盐水，2 wk后取肺组织做HE及Masson染色，光镜检查.

　　1.2.2PMVECs培养及鉴定

　　按［4］的方法取大鼠外周肺组织，修剪成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，置于培养液预湿的盖玻片上，孵箱内静置2 h后加入含200 mL/L胎牛血清的DMEM培养液继续培养， 60 h后去除组织块并换液， 待细胞汇合成单层后取出备用. 倒置显微镜下观察， 抗Ⅷ因子抗体免疫细胞化学染色鉴定. 实验及鉴定均采用原代细胞.

　　1.2.3PMVECs ［Ca2+］i检测

　　PBS洗3次，加入100 μL Fluo?2/AM工作液，孵育40 min，PBS洗3次，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞荧光强度.

　　1.2.4间接免疫荧光染色

　　细胞爬片乙醇固定，染色步骤按试剂盒说明进行. 兔抗IKca1多克隆抗体及FITC?羊抗兔IgG工作浓度分别为1∶15，1∶32，空白对照用PBS代替一抗，缓冲甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察.

　　1.2.5免疫细胞化学染色

　　细胞爬片冷丙酮固定，染色步骤按试剂盒说明进行(SABC法)，兔抗IKca1多克隆抗体工作浓度1∶30. 采用计算机图像分析后苏木素轻度复染，脱水，透明，封片.

　　统计学处理: 应用SPSS 10.5软件，两组均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1肺组织光镜观察

　　HE染色对照组肺泡结构完整，肺泡壁无增厚；PF组部分肺泡腔消失，肺泡壁明显增厚，其中可见胶原纤维沉积；Masson染色对照组肺泡组织结构完整，肺间质中可见少量染成蓝色的胶原纤维；PF组肺组织结构紊乱，可见大量胶原纤维沉积于肺间质内.

　　2.2PMVECs鉴定

　　原代培养的内皮细胞呈铺路石样从组织块边缘爬出，透光性好，周边可见少许成纤维细胞（图1A）.Ⅷ因子免疫细胞化学染色见细胞胞浆内呈棕黄色染色（图1B）.

　　2.3［Ca2+］i测定

　　游离Ca2+主要位于内皮细胞胞质内. PMVECs内［Ca2+］i对照组为95.79±13.51，PF组为166.56±24.17，两组比较差异具有统计学意义（n=9，t=7.668，P<0.01，图2）.

　　2.4IKca1表达

　　IKca1主要在细胞膜上表达. 机图像分析平均灰度值对照组为189.78±13.73 （n1=83）， PF组为169.08±14.81 （n2=88）， 两组比较差异具有统计学意义（t=9.486， P<0.01）； 平均荧光强度对照组为958.75±188.84， PF组为679.29±206.98， 两组比较差异具有统计学意义（n=14，t=3.732，P<0.01，图3）

　　3讨论

　　PF是各种原因引起的弥漫性肺间质疾病的最终结果，是机体对肺组织损伤过度修复的表现［5］.人类的特发性肺纤维化与BLM诱导大鼠PF模型病理过程极其相似.在肺泡炎和进行性纤维化区域，常常伴有PMVECs的新生和增生［6］.崔光彬等［7］发现PF时PMVECs间紧密连接呈持续开放状态，缝隙连接蛋白Cx43表达下降，血管内皮生长因子等细胞因子表达增高［8-9］，血管通透性增高，提示内皮屏障功能的异常与PF的形成有关.细胞骨架、细胞间粘附连接和紧密连接是调节微血管内液体及各种大分子物质外渗屏障功能的重要因素，三者通过肌动蛋白在结构和功能上相关联，且受细胞内［Ca2+］i的影响［10-11］. 本实验中PF大鼠PMVECs内［Ca2+］i较对照组明显增高， 证实钙过载是PF时血管通透性增高的主要原因.

　　内皮细胞胞浆［Ca2+］i升高主要有两种途径：内钙释放和外钙内流.长期维持细胞内较高的［Ca2+］i必须依赖外钙内流.已知PMVECs表达T型电压门控性钙通道，特点是电导小，失活快，其活性与细胞膜电位密切相关：弱的去极化电流即可激活，而细胞膜超极化则使其失活［12-13］. IKca对于微血管内皮细胞膜电位的维持具有重要的负反馈作用［2］. 本实验结果显示，IKca1在PF组内皮细胞表达下调.我们认为，由于IKca是调节内皮细胞T型电压门控性钙通道的主要上游调节因素，其蛋白表达量的下降可能导致了通道功能的变化，如对细胞内［Ca2+］i敏感性下降等.当细胞内［Ca2+］i上升时通道不能及时开放，或者伴有开放频率的减少，致使细胞膜超极化障碍，T型电压门控性钙通道关闭不全或者不能关闭，最后致使PF大鼠PMVECs内［Ca2+］i过载，细胞收缩，细胞间隙增大，从而成为内皮屏障功能异常的重要启动因素之一. 这种内皮屏障功能的持续异常为大分子物质跨内皮交换提供了旁路途径，对PF时炎症细胞进入肺泡、肺间质及激活成纤维细胞，引起过度修复具有重要意义.

【】
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