奶粉中阪崎肠杆菌分离株表型特征分类
1 材料与方法
1?1 材料 (1)标准菌株：阪崎肠杆菌ATCC29544，ATCC29004，ATCC51329，ATCC12868。(2)阪崎肠杆菌分离株：分离自国内市场奶粉抽查样品，共18株。经AP120E和英国荧光快速微生物鉴定／药敏分析仪，2种系统对阪崎肠杆菌的鉴定概率(％)。检验检疫菌种保藏中心(IQCC)10403-1(98?4，98?48)；10403-2(98，94?89)；10403-3(98?4，99?95)；10403-4(98?4，92?30)；10403-5(98，92?37)；10403-6(98，99?35)；10403-7(98?4，99?3)；10403-8(98?4，97?96)；10403-9(98，97?26)；10403-10(98?4，95?96)；10403-11(98，99?6)；10403-12(98?4，99?26)；10403-13(98，99?26)；10403-14(98，100)；10403-16(98?4，99?51)；10403-17(98，98?22)；10403-18(98，99?35)；10403-23(98，99?6)。(3)试剂与培养基：脑心浸液肉汤(BHI)(美国Difico公司)；胰酪胨大豆胨琼脂(TSA)、营养琼脂(北京陆桥公司)；API20E(法国生物梅里埃公司)；阴沟肠杆菌噬菌体(广州虎克生物技术有限公司)。
1?2 方法
1?2?1 菌株培养 将每株参考菌株和分离菌株分别接种于灭菌BHI肉汤，36℃培养24h，再接种于TSA斜面，36℃培养24h，作为储备菌株，试验时从储备菌株用接种环接种于营养琼脂，划线分离37℃培养24h形成单菌落。
1?2?2 阪崎肠杆菌的生化特征及噬菌体裂解实验 API20E实验：将试验菌株，按照API20E使用说明进行操作，36℃培养22～24h后，按照说明书滴加相关试剂，观察和记录结果。噬菌体裂解实验：接种针轻点生长于营养琼脂上的单个纯菌落，通过管壁研磨使其均匀分散在2ml普通肉汤中，约100CFU／ml，取1接种环(约100μl)菌悬液涂布于经过预处理(90mm，20ml，放42～44℃恒温箱30min使表面干燥)的营养琼脂表面，干燥(同前)，取100μl阴沟肠杆菌噬菌体滴加于营养琼脂表面，36℃培养22～24h，观察裂解结果，以融合裂解、不完全裂解和不裂解记录实验结果。
1?2?3 阪崎肠杆菌的表型特征分类 以ATCC参考菌株在API20E上反应的生化特征为生物1型，对于阪崎肠杆菌分离株，去掉相同的生化反应，保留不一致的生化反应项目进行分析，每1种与参考菌株不同的生化特性为1种新的表型。
2 结果
2?1 API20E测定结果 API20E共有21项生化反应，主要区别在于伏-普试验(VP)、肌醇和山梨醇方面，4株ATCC参考菌株生化反应一致，鉴定数值为3305373，7株分离株与参考菌株一致(38?9％)，将参考菌株的表型特征定义为生物1型，按照伯杰氏细菌手册分类方法［2］，VP、肌醇、山梨醇分别为+、+、-，与生物1型相比，肌醇阴性为3株，比例为16?7％，为生物2型；VP阴性9株，比例为50％，为生物3型；山梨醇阳性2株，比例为11?1％，为生物4型；尿素阳性，1株，比例为5％，为生物5型；精氨酸阴性1株，比例为5％，为生物6型。
2?2 阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验 4株ATCC阪崎肠杆菌菌株和18株分离菌株经阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验，1株分离株被融合裂解，编号为IQCC10403-18，1株为不完全裂解，编号为IQCCl0403-13。
3 讨论
1999年，Nazarowec-white和Farber对临床和食品中分离到的17株阪崎肠杆菌以及1株ATCC29544进行了表型特征分类［3］，以ATCC29544参考菌株表型反应作为生物1型，与该生化反应模式比较，山梨醇阳性反应株列为生物2型，VP阴性为生物3型。 本实验采用此方法，对22株(包括4株ATCC参考菌株)进行分析，但实验结果存在差异。首先，ATCC参考菌株反应数值为3305373，而不是3304373，也即差异在VP实验。本实验4株参考菌株VP反应均为阳性，经典考夫曼方法重复实验结果也为阳性，伯杰氏手册中阪崎肠杆菌的VP反应阳性率为90%～100％［2］，临床微生物学手册为≥90％［4］。但本实验的分离株VP阳性率为50％，这可能与VP实验结果判断临界点有关。本实验之所以进行阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验，是因为阪崎肠杆菌在1984年前属于阴沟肠杆菌，包括参考菌株在内的22株菌，有2株分离株能被阴沟肠杆菌噬菌体裂解，这2株均产黄色素，API20E鉴定为阪崎肠杆菌的概率为98％，英国先德荧光快速微生物鉴定／药敏分析仪鉴定为阪崎肠杆菌的概率>99％。此外，还出现尿素反应阳性和精氨酸反应阴性的阪崎肠杆菌菌株，在对阪崎肠杆菌的鉴别中值得注意。
【参考】
〔1〕 Joshua B Gurtler,Jeffrey L Kornacki,Larry R Beuchat.Enterobacter sakazakii:A coliform of increased concern to infant health［J］.International Journal ofFood Microbiology,2005,104(1):1-34.
〔2〕 李蓉，徐迪诚.微生物分类和鉴定技术进展［M］.上海：光明日报出版社，1989：39-46.
〔3〕 M,Nazarowec-white,JM Farber.Phenitypic and genotypic typing of food and clinical isolates of Enterobacter sakazakii［J］.J Med Microbiology,1999,48(3):559-567.
〔4〕 徐建国，梁国栋，邢来君，等(译).临床微生物学手册［M］.7版.北京：出版社，2005:678.
