猫抓病的实验室诊断研究进展
1 汉赛巴尔通体分离培养
汉赛巴尔通体是一类革兰阴性、氧化酶阴性、营养条件要求苛刻的需氧杆菌。镜下观察可看到一群微小的、弯曲状的革兰阴性棒状小体。巴尔通体可在37℃含5％CO2的血培养基(如含5％羊血的胰酶大豆琼脂、巧克力琼脂、脑心浸液琼脂等)上生长，也可在含小牛血清的肉汤及组织中培养。巴尔通体在血琼脂培养基上生长缓慢，一般培养12～14d才能看到典型的菌落生长，有时需45d。菌落呈灰白色圆形突起，边沿光滑或粗糙，接种环刮起后可见圆形小坑，是巴尔通体菌落向培养基中下陷生长的现象〔4〕。在传代培养阶段，通常只需3～5d就长出克隆菌落。适合分离巴尔通体的标本有血液、淋巴组织、吸出物、皮肤及其他器官的活检标本。对于无其他临床症状的CSD病人来说，淋巴标本要优于血液标本。对于反复发烧、心内膜炎、杆菌性血管瘤(Bacillary Angiomatosis，BA)，肝紫癜(Peliosis hepatitis，PH)及其他系统损伤的病人来说，血培养的效果较好。对于血液和淋巴标本来说，细胞培养也证明是有价值的方法。
2 PCR检测核酸扩增技术的应用，尤其是广谱PCR技术和基因测序已经成功用于检测和确诊巴尔通体感染。为评估PCR方法的检测效能，Sophie W等〔5〕用特异性引物对46名临床确诊的CSD病人进行htrA基因的PCR扩增,结果45份扩增出414bp的阳性片断，灵敏度高达98%，特异度100%(41/41)。而Hansmann〔6〕用同样的引物对临床CSD病人的淋巴标本进行PCR检测，灵敏度仅76%。通过对汉赛巴尔通体16S rRNA编码基因进行分析，可区分出2种不同的基因型即Houston-1和Marseille型〔7〕，同时也代表了人类分离株的2种不同的血清型(Houston Ⅰ;Marseille Ⅱ型)〔8〕。另外，柠檬酸合成酶基因(gltA)、16S核糖体DNA(rDNA)、DNA指纹印迹分析如重复序列聚合酶联反应(REP-PCR)和肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)等也可用于区分汉塞巴尔通体的2种基因型。Hsp60基因groEL〔9〕和rpoB〔10〕的序列变异可在种水平上区分出汉塞巴尔通体及其2种不同的基因型。Zeaiter等〔11〕分别用起源于基因间隔区(ITS)、groEL及pap31序列的3对特异性引物对临床确诊的CSD病人的淋巴活检标本进行PCR检测，扩增出3种特异性基因片断，证明ITS引物种属水平上检测巴尔通体，groEL引物则可区分出2种不同的汉赛巴尔通体即Houston-1和Marseille型，而pap31引物则能更详细的区分出4种不同的汉赛巴尔通体亚型即Marseille,CAL-1,Houston-1和1种新的变异性ZF-1。但PCR方法尚存在很大缺陷，如PCR引物结合缺乏特异性，实验室污染等。
3 血清学方法分离巴尔通体通常既耗时又不易成功，PCR在检测临床样品时可作为一种快速特异的病原检测方法，但需要适当的实验设备和器材。对于许多临床实验室来说，确诊临床可疑CSD最实用的诊断方法是血清学检测。
3?1 免疫荧光抗体检测(IFA) 汉赛巴尔通体作为CSD的主要致病菌，主要是依靠IFA的血清学方法进行检测。汉赛巴尔通体易于自动黏附，这种细菌成簇的现象会阻碍产生分散的全菌抗原，血清学检测的灵敏度因不同实验室而异，从100%到30%以下不等〔12〕，在预测IFA诊断效能的早期报道中,用汉赛巴尔通体IgG≥1∶64的滴度检测CSD,灵敏度为84%(38/45),特异度为96%(108/112)。另一项研究表明，对于临床诊断的CSD病例，88％的汉赛巴尔通体IgG≥1∶64，而世界各地的健康人群调查，汉赛巴尔通体抗体阳性率在3?6%～11%不等。2003年Rolain等〔13〕用PCR确诊的200名CSD病人血清进行IFA方法的评估，结果发现，其灵敏度86?8%,特异度74?1%，阳性预测值为79?6%。Michael等〔14〕用商业化的巴尔通体IgG抗原片(MRL)检测城市和人群猫抓病血清标本,灵敏度和特异度分别为84?6%和93?4%。Bergmans等〔15〕认为，用IFA方法进行检测时，汉赛巴尔通体与Vero细胞混合培养几天要比混合培养几小时的灵敏度要高。IFA主要用来检测抗B henselae IgG抗体，对抗IgM的检测不理想。另外，来自观察者的变异也影响结果的判断，IFA也不适合自动化操作和大规模样本检测。另外，当用细菌全细胞作为抗原时，则存在特异性抗原的血清学交叉反应，尤其是与五日热巴尔通体之间的交叉反应〔16〕。
3?2 酶免疫学实验(EIA) 目前，用于巴尔通体酶免疫试验多是用灭活的细菌全抗原和提取的外膜蛋白抗原。常规的外膜蛋白的制备方法〔17〕是将巴尔通体菌株接种在含5％的血琼脂培养基上，在37℃，5％CO2环境中培养1周左右，收集菌落用缓冲液悬浮、洗涤并离心，56℃ 30min灭活后，用超声波粉碎机粉碎并离心除去较大的细胞碎片和细胞器等，对上清液进行约100000g超速离心1h，取沉淀悬浮于缓冲液中，离心重复3次。最后，取沉淀悬浮于蒸馏水中即可。用外膜蛋白包被高吸附ELISA板，进行酶联免疫抗体的测定是国外实验室较常用的方法。Patnaik等〔18〕用EIA方法检测确诊的CSD病人，其中94％的血清抗汉赛巴尔通体IgG阳性，10％的对照阳性，仅2％的健康献血者中抗汉赛巴尔通体IgG阳性。
3?3 血清学检测影响因素 几个因素可能会影响血清学检测的灵敏度。首先，灵敏度根据疾病的定义不同而改变。CSD曾被定义为局限性淋巴管炎伴特征性组织病理学变化(肉芽肿)，有猫接触史和猫抓的皮肤损伤点，皮肤抗原检测阳性，并排出其他原因造成的淋巴管炎。近年来，这些限制性的诊断方法已很少使用，皮肤的抗原检测由于其潜在的健康隐患已逐渐被淘汰，淋巴活检也很少使用。然而，很多抗汉赛巴尔通体抗体水平较高的病人却没有明显的猫接触史，许多病人也没有明显的CSD特征，用上述限制性的定义可能会高估血清学检测的灵敏度。另外，临界值的高低也可影响到血清学灵敏度，Zangwill等〔19〕报道的灵敏度和特异度分别为84％和90％，若临界值定在1∶512，特异度可高达99％，而灵敏度则下降到64％。巴尔通体菌株在血琼脂培养上进行传代培养，即使是有限的几代，与从猫血中新鲜分离的菌株相比，也能导致菌株毒力的减弱，从而产生较低的抗体反应〔20 〕。另外，抗原的制备对结果的影响也很大，同细胞培养菌株相比，用琼脂培养基培养的菌株制备的抗原其A值偏低。另外，抗原变异也可导致较弱的抗原抗体反应〔8〕。血清学方法尤其是IFA,已经是临床及实验室诊断猫抓病最广泛和实用的方法，但血清学方法不能区分出汉赛和五日热巴尔通体的感染。Sander等〔21〕报道的猫抓病人中，两者之间的交叉反应高达95%以上。汉赛巴尔通体与Coxiella burnetii 和Chlamydia psittaci 之间也存在较强的交叉反应〔16,22〕。在进行免疫学检测之前，对可能造成交叉反应的抗原进行血清吸收试验，可提高检测效果〔18〕。另外，用当地的分离株或混合株作为抗原用EIA和IFA检测可提高血清学诊断CSD的效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹分析(western blotting)也是实验室常用的诊断猫抓病的辅助方法，通过不同的SDS-PAGE蛋白电泳图分析，可区分出不同巴尔通体种属，用无日热巴尔通体、汉赛巴尔通体、杆菌性巴尔通体(B bacilliformis)及伊丽莎白巴尔通体(B elizabethae) 的抗血清做Western blotting 实验，也能区分出不同的巴尔通体种属和亚种。一些实验室也用斑点杂交试验和细胞脂肪酸分析进行猫抓病及巴尔通体感染的辅助检测。
4 结语
人们认识猫抓病已有100多年，但直到1990年Relman从1名HIV感染者的杆菌性血管瘤组织样本中分离出汉赛巴尔通体后，才证实此微生物也是人类猫抓病的病原体。随着国际国内交流的频繁，尤其是家庭饲养的猫狗等宠物不断增多，特别是国外引入的宠物越来越多，使得从国外传入该病的可能性加大，因此，对于猫抓病的相关研究应该引起足够的重视。
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