焦化作业工人淋巴细胞HSP70表达及作用
【摘要】 目的 探讨热应激蛋白70（HSP70）在焦炉工人外周血淋巴细胞的表达水平及其意义。方法 用微核试验和碱性单细胞凝胶电泳技术（彗星试验）检测淋巴细胞的染色体畸变和DNA损伤情况 ，用蛋白印迹（western blot）法检测淋巴细胞HSP70表达水平。结果 外周血淋巴细胞微核率和彗星尾长在高暴露组显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；HSP70的表达水平在高暴露组、低暴露组和对照组分别为1.12±0.36,1.34±0.83,0.89±0.40，低暴露组明显高于对照组（P<0.05）；高暴露组工人的外周血淋巴细胞HSP70的表达水平与彗星尾长呈负相关（r=-0.416,P=0.03）。结论 焦炉作业环境可诱发外周血淋巴细胞HSP70蛋白表达，较高水平HSP70的表达对细胞DNA损伤具有保护作用。
【关键词】 焦炉工人
热应激蛋白(Heat Stress Proteins,HSPs)是生物体内一种高度保守的蛋白质，热应激蛋白70（Heat Stress Protein70,HSP70）是热应激蛋白家族中最保守和最重要的一族，在机体细胞耐受形成、机体免疫调节、基因调控、细胞增殖分化、肿瘤发生等过程中发挥重要的生物学功能〔1〕。有报道显示，多环芳烃也可能影响HSP70的表达，但结论不一〔2，3〕，其表达与多环芳烃引起的DNA损伤间的关系尚不清楚。本研究主要通过测定焦炉工人外调血淋巴细胞的染色体畸变和DNA损伤以及HSP70表达水平的变化，探讨以多环芳烃为主要暴露因素的焦化作业工人外周血淋巴细胞HSP70的表达特征以及在DNA损伤中的作用，为焦炉工人肺癌的早期诊断和预防及生物标志物的研究提供依据。
1 对象与方法
1?1 对象 选取某焦化厂焦炉作业工人49名为研究对象。工龄5年以上，年龄30～45岁，均为男性。按工作性质及环境监测结果，分为高暴露组30人（炉顶工、炉侧工）、低暴露组19人（炉底工）；选取距该焦化厂2km处的疾病预防控制中心31名男性工作人员为对照组，工龄、年龄相仿均无有毒有害作业接触史。
1?2 方法 （1）问卷调查：用由职业医学专家设计的统一调查表，按照统一的方法及标准，进行面对面询问调查。调查内容包括一般情况、身体状况、既往史、遗传史、职业史、生活环境、用药情况、营养调查、生活习惯等。（2）环境监测：采用个体采样方法进行采样。分别选取炉顶、炉侧、炉底和对照区工人各2名，随身携带HSF513型个体采样器（美国Gilian公司），流量2L/min，连续采样6h，每个工作区重复测定2次。采用Varian-Prostar高效液相色谱仪（美国Varian公司）检测苯并（a）芘［B(a)p］浓度。用干球温度计测定工人作业场所温度。（3）微核试验：取肘静脉血1ml，用甲基纤维素法制片，4℃冰箱甲醇固定5min,Giemsa染色10～15min，油镜下观察。计数1000只形态完整的淋巴细胞微核数，以‰表示。（4）碱性单细胞凝胶电泳（彗星试验）：参照［4］方法。按文献［5］方法分离淋巴细胞，制备单细胞悬液与等量质量浓度为1%的低熔点琼脂糖混合，包埋在磨砂玻片上制成凝胶板。经裂解、解旋、电泳、中和及脱水后以溴化乙锭（EB）进行染色，在荧光显微镜（日本Nikon公司）590nm波长的激发光下进行观察，每份样品记数50个细胞，用Comet IMI1?0软件测量尾长〔6〕。（5）蛋白印迹（Western-blotting）法：静脉采血，肝素抗凝，分离淋巴细胞，采用总蛋白定量试剂盒（美国Bio-Rad公司）进行总蛋白定量，调节蛋白浓度一致。其中一抗用兔抗人HSP70（美国Stressgen公司），4℃过夜，然后在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤3次，每次15min；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（美国KPL公司），室温振荡1h，PBS洗涤3次，每次15min，电化学发光（ECL）发光剂（英国Amersham公司）显色。结果扫描保存，用Gelpro32分析软件进行定量分析。HSP70相对表达值的均以对照的blot积分吸光度值为基准，用其余各组blot积分吸光度值与对照的blot积分吸光度值之比值表示。
1?3 统计分析 应用SPSS10?0软件进行方差分析和相关分析。
2 结果
2?1 研究对象的一般情况 某焦化厂焦炉作业工人49名。其中，高暴露组30名，平均年龄（39?73±1?74）岁，平均工龄（19?24±3?86）年；吸烟者23名，占78%；饮酒者14名，占44%；低暴露组19名，平均年龄（39?42±2?03）岁，平均工龄（16?72±6?35）年，吸烟者15名，占79%；饮酒者9名，占46%。无任何有毒有害作业接触史的对照组31名，平均年龄（39?48±2?16）岁，平均工龄（18?13±5?19）年；其中吸烟者25名，占80%；饮酒者12名，占40%。所有被调查者均为男性，统计分析显示，3组在年龄、工龄、吸烟、饮酒方面差异无统计学意义（P>0?05）。
2?2 作业场所环境监测结果 炉顶、炉侧、炉底工作区的〔B(a)p〕浓度分别为（0?35±0?02），（0?10±0?00），（0?045±0?007）μg/m3，分别为对照（0?02±0?00）μg/m3的17?5,5,2?25倍；作业场所环境温度分别为13?1,8?8,13,7?8℃。
2?3 淋巴细胞微核率、DNA损伤情况及HSP70表达（表1） 高暴露组的微核率和彗星尾长均显著高于对照组（P<0?05）；低暴露组HSP70表达水平明显高于对照组（P<0?05），而高暴露组的HSP70表达与对照组间差异无统计学意义（P>0?05）。
表1 各组淋巴细胞微核率、DNA损伤结果及HSP70表达水平（略）
注：与对照组比较，*P<0?05
2?4 淋巴细胞彗星尾长和HSP70相关分析 在高暴露组，淋巴细胞彗星尾长与HSP70表达水平呈负相关（r=-0?416,P=0?038）；在低暴露组和对照组无明显相关关系（r分别为0?013,0?092，P>0?05）。
3 讨论
在炼焦过程中，工人暴露于高温和焦炉逸散物（Coke Oven Emission,COE）等多种有害环境中，焦炉逸散物可诱发焦炉工人遗传物质损伤〔7，8〕，其中多环芳烃为主要遗传毒物，与焦炉工人肺癌危险性的增高有关。HSP70是与职业损伤保护作用最为密切的应激蛋白之一，HSP70含量的增加，有利于抵抗外来刺激，保护机体细胞免受损伤。有研究表明，高温及焦炉逸散物中一氧化碳，二氧化硫、苯、粉尘等均可影响机体HSP70表达〔9，10〕。本次研究发现，在低暴露组淋巴细胞HSP70的表达明显增高，而在高暴露组又有下降的趋势，与高雅娟〔3〕的研究结果一致。推测HSP70的表达下降可能与高剂量〔B(a)P〕的抑制作用有关。通过进一步分析发现，在高暴露组，淋巴细胞HSP70水平与DNA损伤（彗星尾长）呈明显的负相关（r=-0?416,P<0?05）,提示较高水平HSP70的表达对细胞具有保护作用，减轻DNA损伤。但其机制尚不清楚。因此，从职业应激的角度来讲，控制多环芳烃特别是〔B(a)P〕暴露，将有利于调节机体HSP70的表达水平，增强机体对职业有害物质损伤的耐受，从而更好地提供细胞保护作用。机体HSP70表达水平也可作为监测〔B(a)P〕暴露和机体细胞损伤的辅助指标。
【】
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