细胞外信号调节激酶在局灶性脑缺血中的表达
【关键词】 脑缺血；再灌注；丝裂原激活蛋白激酶类；细胞凋亡；梗塞,大脑中动脉；大鼠
Expression of extracellular signalregulated kinase in focal cerebral ischemia
【Abstract】 AIM: To study the role of extracellular signalregulated kinase (ERK) during focal cerebral ischemiareperfusion in hippocampal neurons of rats. METHODS: Sixty male adult Wistar rats were randomly divided into 2 groups (n=30 per group): the sham operation group and the ischemiareperfusion group(I/R group). The rats of I/R group were subjected to 2 h of right middle cerebral artery occlusion (MCAO) with introducing a nylon suture to the right internal carotid artery and then 3, 6, 24, 48 and 72 h of reperfusion, respectively(as 5 subgroups, n=6 in each subgroup). The histopathologic changes were observed by HE staining. The apoptotic neurons were detected in CA1 area of hippocampus by TUNEL method. ERK phosphorylation was detected by immunohistochemistry. RESULTS: In I/R group as compared with shamoperation group, after MCAO, the survival neurons in CA1 areas decreased; a lot of apoptotic cells were observed and peaked at 48 h; ERK activity increased 3 h after MCAO and peaked at 6 h and returned to the normal level at 72 h. CONCLUSION: Cerebral ischemiareperfusion may result in the upregulation of ERK activity, and participate in the process of neuron apoptosis.
【Keywords 】 brain ischemia; reperfusion; mitogen activated protein kinases; apoptosis; infarction, middle cerebral artery; rats
【摘要】 目的： 研究细胞外信号调节激酶（ERK）在局灶性脑缺血再灌注海马神经元中的表达. 方法：线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型. 大鼠随机分成假手术组（sham组）、脑缺血再灌注组（I/R组），每组根据再灌注时间不同再分为3, 6, 24, 48和72 h亚组，每亚组各6只鼠. 在预定时间点进行HE染色观察组织学变化；TUNEL法检测CA1区细胞凋亡的动态变化；免疫组织化学方法研究ERK的表达特征. 结果：MCAO后海马神经元存活数量较假手术组明显减少；凋亡细胞大量出现，以48 h为高峰；MCAO后3 h，磷酸化ERK在局灶性脑缺血大鼠脑组织中显著升高，6 h达到最高峰，72 h恢复到正常水平. 结论： 脑缺血再灌注损伤可能导致ERK活性上调，参与缺血后神经细胞凋亡过程.
【关键词】 脑缺血；再灌注；丝裂原激活蛋白激酶类；细胞凋亡；梗塞，大脑中动脉；大鼠
0引言
近年来人们对脑缺血再灌注损伤进行了广泛研究，认为细胞信号转导参与调节中枢神经系统神经细胞的损伤. 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activation protein kinases, MAPKs）通过磷酸化转录因子而改变基因的表达水平，在细胞信号转导中起着重要作用，参与细胞生长、发育、分化及凋亡等生理、病理过程. MAPKs的3个亚组： ERK, P38和cJun氨基末端激酶（cJunNH2terminal kinase, JNK）. 他们可被许多因子激活，并通过调节转录因子活性而控制基因表达［1］. 研究发现ERK, p38和JNK在心、脑、肝、肾等组织细胞的缺血/再灌注过程中可被激活［2-3］. 我们选用大鼠大脑中动脉栓塞模型，测定在再灌注后不同时间点，缺血脑海马CA1区ERK的活性特征及细胞凋亡的动态变化规律,试图阐明ERK在大鼠脑缺血再灌注过程中所起的作用和机制.
1材料和方法
1.1材料凋亡检测试剂盒、ERK试剂盒、DAB显色剂均购于武汉博士德公司. 健康雄性Wistar大鼠60只，体质量200～250 g，由兰州大学试验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1实验动物分组大鼠于术前在22～25℃环境中饲养1～2 d，术前夜禁食，随意进水. 随机分成假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)，根据再灌注时间不同每组再分为3, 6, 24, 48和72 h, 5个亚组，每亚组各6只鼠.
1.2.2模型制作根据Nagasawa等［4］的改良线栓法制成大鼠大脑中动脉缺血模型. 用水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，将其仰卧固定，分离右侧颈总动脉（CCA），颈内动脉（ICA）及颈外动脉（ECA），结扎ECA与CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA 与ICA分叉下方剪一切口，将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉，插入深度为(18.5±0.5) mm，直到有轻微阻力感为止，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血. 结扎入口处，尼龙线外留约1 cm，缝合皮肤. 2 h后轻轻提拉所留线头至略有阻力，实现大脑中动脉再灌注，造模完成. 在缺血2 h和再灌注1 h内，用白炽灯加热维持大鼠的体温，体温维持在肛温36.5～37.5℃. 假手术组只分离CCA与ECA.动物模型建立成功后按Longa等［5］法对动物的神经功能进行评分，均在2～3分，即以动物清醒后，爬行时向左转圈（追尾现象），提尾时左前肢内收屈曲. 未达到上述标准者视为模型制作失败，不计入实验组. 因麻醉未清醒和经解剖发现存在有蛛网膜下腔出血者均视为模型制作失败，不计入实验组.
1.2.3组织切片的制备大鼠再灌注后于3, 6, 24, 48和72 h各时间点，用水合氯醛深度麻醉动物后开胸暴露心脏，经升主动脉插管剪开左心耳，用生理盐水250 mL快速冲洗，随后用多聚甲醛磷酸盐缓冲液（4℃, pH 7.4）先快后慢灌注约250 mL固定，断头取脑后, 在多聚甲醛中固定6～8 h，取视交叉后1～4 mm脑块进行石蜡包埋，冠状面切片，取齿状回与海马互包平面的切片，片厚3 μm.
1.2.4HE染色、组织学观察3 μm切片贴片，空气中干燥，入二甲苯脱脂，乙醇梯度脱水，苏木素伊红（HE）染色，二甲苯透明，中性树脱封片，取24, 48, 72 h组大鼠切片在400倍光镜下计数海马CA1区中段100单位长度内存活神经元数目.
1.2.5免疫组织化学采用免疫组化SABC法进行染色. 切片上滴加1∶200兔抗ERK抗体，4℃孵育过夜，接着用生物素连接的羊抗兔二抗在室温下反应90 min，再用卵白素生物素复合物室温下反应90 min，最后用DAB溶液显色，苏木素复染细胞核. 贴片，空气中干燥，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，在显微镜下计数海马CA1区中段100单位长度内ERK染色阳性细胞数.
1.2.6原位细胞凋亡检测取海马冠状石蜡切片，常规二甲苯、乙醇脱蜡至水. 蛋白酶K（20 mg/L）室温消化，用甲醇配制的过氧化氢消除内源性辣根过氧化物酶活性，加末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）与地高辛标记的dUTP混合反应液进行孵育，再加辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育，用DAB显色，核呈深棕黄色者为凋亡细胞，最后脱水透明封片. 在40×10倍Olympus显微镜下摄像观察各组间细胞凋亡变化趋势. 在400倍光镜下计数海马CA1区中段100单位长度内TUNEL染色阳性细胞数.
统计学处理： 所有数据以x±s表示，用SPSS10.0统计软件分析，两组资料不同的时间测量值比较采用重复测量的方差分析，检验水准取α＝0.05.
2结果
2.1HE染色、海马CA1区组织学改变假手术组中可见大鼠神经元数量多，排列整齐，形态完整；缺血组有神经元细胞肿胀，分布不均，细胞周围间隙增宽，有的细胞体积缩小，核固缩深染（图1）. sham组大鼠术后各时间点存活神经元数目无变化. I/R组大鼠CA1区存活神经元数在I/R后48和72 h显著少于I/R后24 h（P<0.05）. 与sham组相比较，大鼠I/R后各时间点海马CA1区存活神经元数目均明显减少(表 1).
A： 假手术组；B：缺血再灌注组.
图1海马CA1区神经元改变HE ×400（略）
表1大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区存留神经元数目（略）
aP<0.05 vs假手术；cP<0.05 vs缺血再灌注24 h.
2.2免疫组织化学染色及定量分析ERK染色阳性呈现棕黄色颗粒状，在细胞核内及胞浆内均有表达. ERK活性表达于再灌注后3 h明显增加，阳性细胞胞体较大，并有树枝状突起，主要分布于缺血皮层细胞层及皮层下区域，如海马分子层、基底节外层及缺血侧胼胝体. ERK活性于再灌注后6 h达到高峰（图2），72 h恢复到正常水平. 除72 h I/R组ERK活性表达与sham组比较无显著差异外（P>0.05），其余I/R组ERK活性表达较sham组均有明显增加（P<0.01）（表 2）.
A： 假手术组；B：缺血再灌注组.
图26 h组免疫组织化学染色海马CA1区神经元SABC ×400（略）
表2大鼠脑缺血再灌注后不同时间点海马CA1区ERK表达阳性神经元数目（略）
P＜0.01 vs假手术.
2.3TUNEL法检测神经细胞凋亡观察各组大鼠海马CA1区，假手术组基本上未见到染色阳性的神经细胞. 缺血再灌注组3 h开始即出现染为黄色的凋亡细胞，随缺血时间延长，凋亡细胞增多，并有细胞核固缩、凋亡小体等凋亡中晚期形态特征出现. 凋亡细胞数于48 h达到高峰（图3），72 h以后凋亡细胞逐渐减少. 缺血再灌注组与对应各时间点假手术组比较调亡神经元数目有显著性差异（P<0.01，表3）.
A：假手术组；B：缺血再灌注组.
图348 h组海马CA1区凋亡神经元TUNEL ×400（略）
表3大鼠脑缺血再灌注不同时间点海马CA1区凋亡神经元数目（略）
P<0.01 vs假手术.
3讨论
ERK传导通路在局灶性脑缺血中发挥重要作用. Wu等［2］报道,小鼠MCAO后30 min到2 h ERK水平(用western blotting检测)在坏死组织中达高峰,在6 h后仍能检测到. 沙土鼠全脑缺血35 min后再灌注10 min,在CA1区检测到ERK增加,但在1 h减少,同时在DG区可检测到ERK活性增加［6］. 因此缺血再灌注时ERK活性的增加是细胞针对缺氧刺激启动修复过程、促进细胞存活的保护性机制,对于经历了缺血/再灌注损伤的神经元具有保护作用. 本实验中，脑缺血再灌注3 h后ERK活性显著增加，于6 h达到高峰，于72 h恢复至对照水平，ERK在神经细胞和胶质细胞中均可见到，表明其发生主要与磷酸化过程有关，在神经组织中的选择性没有很大差异. 缺血/再灌注损伤后组织中ERK活性变化的不一致性可能与实验用动物种属，实验方法及脑缺血/再灌注时间的不同等有关. 就目前的研究结果分析： 缺血/再灌注损伤可使组织细胞的ERK迅速激活,作为早期细胞内信号参与了细胞对这一应激反应的调节.
细胞凋亡是程序性决定基因表达的结果. 在大鼠脑缺血/再灌注模型中凋亡发生最显著的部位是缺血周围区（缺血半影区）及缺血敏感区（如海马）等部位. 大鼠缺血再灌注24～48 h凋亡的细胞最多. 已有充分的证据说明MAPK途径在神经元凋亡中起重要作用. 大鼠局灶性脑缺血20 min或2 h后再灌注12～24 h,在IP区可见到典型的细胞凋亡特征和大量TUNEL阳性细胞,并且凋亡细胞因缺血损伤程度的不同而分布不同［7］. Fukunaga等［8］用BDNF等刺激培养的海马神经元的实验中，证实细胞可通过以RAS/Raf1/MAPK为主的传导通路激活cfos基因. 使用细胞周期依赖性激酶MAPK的抑制剂可防止神经元因撤除神经营养所致的凋亡. 本实验中，缺血/再灌注3 h开始凋亡细胞，于48 h达到高峰，72 h以后凋亡细胞有逐渐减少. 可以认为ERK激活的发生和出现时间较早于凋亡，一方面提示它是凋亡前细胞破坏的酶释放过程；另一方面，凋亡的发生可能有ERK的参与，所以较凋亡为早，应用此指标可以预测和检测凋亡的发生和程度.
局灶性和全脑缺血后，ERK在存活的神经元中活性增加，但在死亡的神经元中活性降低. 本实验中在脑缺血/再灌注72 h，神经细胞大量死亡，所以ERK活性有所降低，较sham组无大差异. 此结果表明ERK的变化有固定的时间过程，不是一个持续的过程. 这一结果提示在较早时间内进行有效干预（恢复缺血）可以阻止缺血再灌注后脑损伤的级联过程，为临床提供了一个时间窗.
对大鼠脑缺血/再灌注损伤后不同部位脑组织ERK表达的测定发现,对缺血耐受性强的海马CA3/DG区ERK活性的增加较对缺血敏感的CA1区明显,随再灌注时间延长,CA3/DG区ERK活性虽有降低,但是,再灌注24 h时仍高于对照水平,而CA1区ERK活性随再灌注时间延长,很快降至对照水平以下. 作者同时检测了膜蛋白的酪氨酸磷酸化,发现CA3/DG区180KD膜蛋白(生长因子受体)的磷酸化再灌注后24 h持续增加,分析此变化可能为缺血刺激引起的胶质细胞释放生长因子所致［9］. ERK部位差别的意义： 皮层下/皮层及多部位均可见到. 这主要与灌注和血流分布有关. 灌注越多的地方发生ERK改变越多. 提示它的改变是I/R的直接作用结果，其I/R和ERK升高是可能是一个短环路，即ERK是一个直接的灌注应答指标.
总之，ERK传导通路在局灶性脑缺血后被激活，并在缺血性组织损伤中发挥重要作用，过量的ERK激活能引起大鼠海马神经元凋亡发生,加重脑缺血再灌注损伤. 针对ERK的变化，进行有效干预可望为急性缺血性脑卒中提供一个新的路径.
【】
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