南宁市儿童ApoB基因Xba I位点多态性分析
作者：胡鹏 经承学 覃远汉 陈萍 李铭芳 裴娟
【摘要】 目的 研究南宁市126名健康体检儿童载脂蛋白B(ApoB)基因Xba I位点各基因型的分布情况，探讨其多态性对儿童生长发育、营养状况、血脂代谢及肾功能的影响。方法 应用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性（PCR?RFLP）技术检测126例健康体检儿童ApoB基因Xba I位点的基因型，体质指数（BMI），测定血清总蛋白（TP）、白蛋白（AIB）、球蛋白（GLO）、白蛋白/球蛋白（A/G）、脂蛋白a（LPa）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL?C）、非高密度脂蛋白胆固醇（non?HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL?C）、载脂蛋白A1、(ApoA1)、ApoB、ApoA1/B、尿素氮（BUN）、肌酐（Ccr）及尿酸（UA）。结果 (1)Xba I位点各基因型的频率分别为X-/X-：92?06%（116/126），X+/X-：7.14%（9/126），X+/X+：0.79%（1/126）；等位基因X-与X+的频率分别为95?63%和4?37%；（2）等位基因X+组血清TP、AIB、A/G和ApoA1/B显著低于X-组，而BMI、LPa、TC、TG、non?HDL、LDL?C、ApoB、BUN和Ccr明显高于X-组。结论 ApoB基因Xba I位点多态性对儿童生长发育、营养状况、血脂代谢及肾功能有影响。
【关键词】 载脂蛋白B；基因多态性；体质指数；总胆固醇；儿童
儿童时期的血脂代谢不仅与生长发育、营养状况及肾功能密切相关，也是成年后心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的重要预示因子〔1〕。Everaldo等〔２〕认为，儿童暴露于各种有害环境因素的机会较成人少，所以环境因素对儿童血脂水平的影响较小，因此，是研究遗传因素对脂质代谢影响的最好群体。本研究选取在血脂代谢与转运途径中具有重要调节作用的基因?载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）基因Xba I位点〔3〕，探讨其多态性对儿童生长发育、营养状况、血脂代谢及肾功能的影响。
1 对象与方法
1?1 对象
2006年6月随机抽取126名南宁市健康体检儿童，其中男72名、女54名，年龄4～12岁，平均（7?2±3?2）岁,所有样本均取自稳态群体,符合Hardy?Weinberg遗传平衡定律（P>0?05）。
1?2 试剂与仪器
引物设计参照Scartezini等〔4〕报道，序列为：上游引物5′?GGAGACTATTCAGAAGCTAA?3′，下游引物5'-GAAGAGCCTGAAGACTGACT-3′（大连TaKaRa宝生物工程有限公司）； PCR扩增试剂盒（上海生物工程服务有限公司）；PTC?220基因扩增仪（美国MJ公司）；Xba I内切酶（大连TaKaRa宝生物工程有限公司），血清指标检测试剂（上海执诚生物技术有限公司），LX?20全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司）；Gel Doc 2000凝胶成像分析系统（美国Bio?Rad公司）。
1?3 基因组DNA提取
〔5〕。
1?4 PCR反应
50?μl反应体系中，10×缓冲液5?μl,dNTP(2?5?mmol/L Takara) 4?μl,上、下游引物各1?μl,模板DNA10?μl,双蒸水29?μl,二甲基亚砜1?μl。96℃预变性5?min后立即置于冰上,加入Taq DNA聚合酶(Takara)0?25?μl,94℃变性1?min,57?4℃退火1?min,72℃延伸1?min,循环40次,最后经72℃延伸10?min。取PCR产物5?μl在2%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下可见在710?bp位置出现一条明亮的条带。
1?5 酶切反应
20?μl反应体系中含10?μl PCR产物，2?μl牛血清白蛋白，2?μl 10×限制酶消化缓冲液，1?μl Xba I内切酶（10?U/μl Takara），灭菌注射用水5?μl。混匀后置衡温水浴箱中37℃酶切6?h。2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
1?6 体格检查
清晨空腹测量身高和体重，计算体质指数。
1?7 血清指标检测
空腹12?h以上清晨采静脉血，取血前最后一餐忌高脂饮食，总蛋白（TP）用双缩脲法测定；白蛋白（AIB）和球蛋白（GLO）用溴甲酚绿法测定；总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和脂蛋白a（LPa）用酶法测定；高密度脂蛋白胆固醇（HDL?C）用选择沉淀法测定；非高密度脂蛋白胆固醇（non?HDL）=TC减去HDL?C；低密度脂蛋白胆固醇（LDL?C）用液体双试剂法检测，ApoA1和ApoB以免疫比浊法测定；血浆尿素氮（BUN）、肌酐清除率（Ccr）和尿酸（UA）采用全自动生化分析仪检测。
1?8 统计分析
选用SPSS 11?5统计软件进行分析，基因型频率和等位基因频率计算采用直接计数法，不同等位基因之间的指标比较采用独立样本T检验。
2 结 果
2?1 Xba I位点各基因型的判定
PCR产物经过酶切后2%琼脂糖凝胶中电泳可得到3种结果。X+/X+在433bp和277bp处出现2条带，X+/X-在710，433和277bp处出现3条带，X-/X-仅在710bp处出现1条带。
2?2 Xba I 位点各基因型及等位基因的分布情况
共检出X+/X+1例，占0?79%，X+/X-9例，占7?14%，X-/X-116例，占92?06%。根据平衡法计算出等位基因X+的频率为4?37%，X-的频率为95?63%。
2?3 Xba I位点各等位基因之间指标比较（表1）
为了观察点突变所造成的Xba I酶切位点对儿童生长发育、营养状况、血脂代谢及肾功能的影响，将X+/X+组与X+/X-组合并成等位基因X+组，X-/X-组作为等位基因X-组，对各指标进行比较。结果显示，等位基因X+组血清总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白和载脂蛋白A1/B显著低于X-组，而体质指数、脂蛋白a、总胆固醇、甘油三酯、非高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B、血浆尿素氮和肌酐清除率明显高于X-组。表1 Xba I位点各基因型之间的指标比较(略)
3 讨 论
本研究共检出X+/X+1例，X+/X-9例，X-/X-116例，根据平衡法出等位基因X-的频率为95?63%，与报道非常接近〔６〕。ApoB基因Xba I位点多态性在血脂转运和代谢过程中发挥重要的调节作用，与高TG、高LDL?C及高ApoB水平密切相关〔7，8〕。等位基因X+可能通过影响脂蛋白与细胞膜受体的亲合力，而导致体内LDL?C分解代谢降低，致使血清LDL?C水平升高；此外，X+还可能增加机体对环境因素的敏感性而影响儿童血脂水平。Verduci等〔9〕对82例苯丙酮尿症患儿ApoB基因多态性与血脂代谢的关系研究发现，携带X+/X+基因型的患儿血浆LDL?C水平显著高于其他基因型，建议应尽早给予低苯丙氨酸和低脂饮食。本研究结果也显示，携带等位基因X+的儿童不仅血清TG、LDL?C和ApoB水平显著增高，而且LPa、TC和non?HDL水平也明显高于X-儿童。然而，有关Xba I多态性对儿童血脂代谢的影响仍存在争议。Islam等〔10〕跟踪研究214例具有冠心病家族史芬兰儿童ApoB基因多态性与血脂代谢的关系，发现Xba I变异并未对血脂水平产生明显影响。朱文丽等〔11〕对308名健康儿童研究发现，ApoB基因Xba I突变对血脂产生无影响，认为健康儿童的血脂水平受多基因的共同作用，Xba I单一位点产生的效应可能非常微弱。因此，建议在研究遗传因素对血脂代谢影响时，应采取多基因多位点的研究方法。儿童时期的血脂代谢与生长发育、营养状况及肾功能密切相关。本研究结果显示，等位基因X+组BMI、BUN和Ccr显著高于X-组，而血清TP、AIB和A/G则明显降低。由此可见，ApoB基因Xba I突变可以通过改变血脂代谢，对儿童的生长发育、营养状况及肾功能造成一定影响。Xba I位点的变异可作为一个基因标记点〔12〕，导致基因连锁不平衡，X+儿童具有肥胖倾向，更容易发生营养不均衡及肾脏损害。因此，对于携带等位基因X+的儿童，应通过调整饮食、加强锻炼、控制体重等措施来改善血脂代谢，并积极地预防高脂血症可能继发的肾脏损害。
感谢广西壮族自治区卫生厅幼儿园、南宁市青山园艺场小学的大力支持
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