Apoptin基因诱导A375细胞凋亡信号转导机制
【关键词】 肿瘤特异性凋亡基因；细胞；凋亡；半胱天冬蛋白酶,
摘要： 目的 研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptin)在诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡中的信号转导机制。方法 用含有apoptin基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375；采用RT-PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪分析检测A375的细胞的凋亡；以比色法检测半胱天冬蛋白酶8(caspase-8)和caspase-3的相对活性。结果 Apoptin基因瞬间传染的A375细胞可出现典型的细胞凋亡所具有DNA梯状带；流式细胞术发现实验组细胞凋亡率明显高于其他各组(P<001)；Caspase-3的活性升高，但caspase-8活性没有明显变化。结论 Apoptin基因可通过激活caspase-3诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡。
关键词：肿瘤特异性凋亡基因；细胞；凋亡；半胱天冬蛋白酶
Study on signal transduction in apoptosis of human melanoma cells A375 induced by apoptin
Lab of Molecular Biology,Center for Disease Control and Prevention,Shenyang Military Command(Shenyang 110034,China)Abstract： Objective To study whether apoptin gene induces apoptosis in human melanoma cells A375 via the activation caspase-8 and caspase-3.Methods The human melanoma cells A375 were transiently transfected with recombinant pcDNAA3 plasmid,which contained apoptin gene,and the apoptosis was measured by DNA agarose electrophoresis,RT-PCR and flow cytometry.Caspase-8 and caspase-3 relative activity was analyzed by colorimetric assay at various time.Results The apoptin gene could induce apoptosis of human melanoma cells A375in vitro and the mRNA of apoptin gene could be detected by RT-PCR.The activity of caspase-3 began to rise in A375 cells after transfected with apoptin gene,but that of caspase-8 did not change.Conclusion Apoptin gene can induce apoptosis in human melanoma cells A375via active caspase-3.
Key words： apoptin;cell;apoptosis;caspase
细胞凋亡是一种机体为维护正常组织形态、体积及功能而与细胞增殖相平衡的主动自杀过程；凋亡发生异常，会导致细胞无限增殖而致癌变发生。在对凋亡机制的研究中，陆续发现了一些诱导细胞凋亡的酶类，其中半胱天冬蛋白酶(caspase)是细胞凋亡的关键分子，细胞凋亡的形态变化是系列caspase活化并水解底物的结果。近年来研究发现，Apoptin可通过独立于p53作用途径、不被Bcl-2过量表达所抑制的方式，特异性诱导人类多种肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，但并不作用于正常细胞〔1，2〕。本研究前期克隆和构建了apoptin基因真核表达载体，并证明该载体对人黑素瘤细胞A375具有明显的凋亡诱导作用〔3，4〕。在此基础上，为了进一步探讨apoptin基因诱导肿瘤细胞凋亡机制，本文探讨apoptin基因在诱导肿瘤细胞A375凋亡时cpspase-8和caspase-3的活性变化。
1 材料与方法
11 材料 Lipofectmina、凋亡细胞DNA提取试剂盒(美国Invitogen公司)；溴化丙啶(PI)和RT-PCR试剂盒(美国Sigma公司)；caspase-8检测试剂盒(美国Calbiochem-Novabiochem公司)和caspase-3底物AC-DEVD-pNA(英国Alexls公司)；流式细胞仪(美国Coulter公司)；550型酶标免疫测定仪(瑞典Bio-Rad公司)。其他化学试剂均为国产分析纯。质粒pcDNAA3由本室构建，内含肿瘤特异性凋亡基因，采用硷变性法大量提取质粒DNA，用PEG沉淀法进行纯化，所得质粒DNA含量为2g/L，纯度达到电泳纯〔5〕。人黑色素瘤细胞A375引自军事医学院。
12 方法
121 细胞瞬间转染 参照Lipofectamin转染说明书进行。转染前24h，将A375细胞重铺在T25培养瓶中，待细胞长至底面积80%时，进行转染。将10μl DNA和20μl Lipofectamin各加入500μl无血清(DMEM)中，轻轻震荡5min，将二者混合即成转染液。室温静置20min，用无血清DMEM洗细胞2次，加入5ml无血清的DMEM，逐滴加入转染液，边加边轻轻混合，置37℃孵育8h。弃去转染液，换含100ml/L新生牛血清的DMEM培养液，继续培养。分别于转染后的不同时间，观察并取转染细胞进行鉴定，用等量的pcDNA31空质粒作转染对照。
122 RT-PCR鉴定 取1×106个转染不同时间的A375细胞，按异硫氰酸胍一步法，提取总RNA，作为RT-PCR的模板，用RT-PCR扩增Apoptin cDNA〔6〕。
123 凋亡细胞DNA鉴定 DNA凝胶电泳，取1×106个A375细胞，加入500μl细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCL pH74、10mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、150mmol/L NaCl、5g/L十二烷基硫酸钠(SDS)及400mg/L蛋白酶K)，于50℃作用3h，不时振摇。加入等体积的平衡酚、氯仿-异戊醇抽提后，以2500r/min离心10min，加25倍无水乙醇沉淀。用700ml/L乙醇沉淀、干燥后，将DNA溶入40μl TE液中，加入20μl的10g/L Rnase，37℃水浴30min。取30μl DNA，进行15g/L琼脂糖凝胶电泳，细胞发生凋亡时可出现梯形条带。
124 apoptin基因诱导A375细胞凋亡的流式细胞术检测 转染后24，48和72h，收集各组细胞于离心管中，用PBS洗2次，加-4℃预冷的乙醇振荡、固定后，于4℃保存过夜；用PBS洗2次弃固定液；200μl RNA酶(RNaseA)震散，于37℃水浴中30min后，加800μl溴化丙啶(PI)染色液，混匀，于4℃避光30min。在活细胞状态下，PI可与凋亡细胞结合，在荧光照射下发红光。400目尼龙网过滤后，用Elite流式细胞仪检测每份样品中的10000个细胞，观察激发波长488nm处的红色荧光。
125 caspase-8活性的检测 按试剂盒方法进行。收集各实验组的细胞(2×106)，加40μl细胞裂解缓冲液，冰浴20min，反复冻融4次，待细胞完全破碎后，于4℃以15000r/min离心5min。收集上清，与200μmol/L的底物(IETD)-pNA混匀，加于微量96孔板中，终体积为100μl/孔，于25℃温育6h后，用酶标仪测定波长405nm的吸光度(A)值。结果以A405值(即底物中对硝基苯胺pNA的释放量)表示caspase-8的活性。
126 caspase-3的活性测定 分别收集转染后细胞，进行caspase-3的活性测定。各组细胞按［7］处理后，加入caspase-3的底物AC-DEVD-pNA，使其终浓度为50μmol/L，置37℃孵育1h后，转移至96孔酶标板中，用酶标免疫测定仪测定A405值，以此来表示caspase-3的相对活性，组间比较采用方差分析。
2 结果
21 转染细胞中Apoptin mRNA的表达 以A375细胞转染后24和48h的总RNA为模板，经RT-PCR均可扩增出apoptin cDNA，表明apoptin已在转染细胞中表达。正常A375细胞和空载体转染细胞均为阴性(图1)。1：DNA分子量DL200； 2：转染后24h；3：转染后48h； 4：非转染A375对照 图1 apoptin瞬间转染A375细胞不同时间RT-PCR结果（略）
22 凋亡细胞DNA琼脂糖电泳 Apoptin瞬间转染的A375细胞有典型的细胞凋亡所具有的DNA梯状条带，表明有凋亡发生(图2)。1～3：转染后24，48，72h细胞DNA；4：非转染A375对照 图2 apoptin瞬间转染A375细胞不同时间凋亡细胞DNA电泳结果（略）
23 apoptin基因诱导A375细胞凋亡的流式细胞术分析 A375细胞以apoptin基因转染后48h，在DNA直方图上的G1峰前，即出现1个明显的亚2倍体峰(亚G1峰，即凋亡峰)，并随着转染时间延长而增强。细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(P<005)。
24 caspase-3和caspase-8相对活性的测定 A375细胞经pcDNAA3质粒转染后24h实验组caspase-3的活性开始升高，72h达高峰，明显高于正常细胞对照组和pcDNA31对照组(P<001)，而caspase-8的活性没有明显变化(表1，表2)。表1 不同时间caspase-3相对活性检测（略）注：与pcDNA31 2组比较，a P<005，b P<001表2 不同时间caspase-8相对活性检测（略）
3 讨论
研究表明，肿瘤特异性凋亡蛋白(apoptin)具有特异诱导人肿瘤细胞和异常转化细胞发生凋亡的作用，而对正常细胞没有毒副作用。在克隆apoptin的真核表达载体的基础，研究apoptin经体外瞬间转染人黑色素瘤细胞A375，观察诱导凋亡的作用。结果显示，在apoptin基因转染后48h，A375细胞出现明显的细胞凋亡特征，而且凋亡细胞的数量与apoptin的转染时间有关，随着时间延长，A375细胞的凋亡比率明显增加。为了探讨在apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡时，是否与caspase-3的激活有关。本研究结果表明，A375细胞经apoptin基因转染后24h caspase-3的活性开始升高，72h达高峰，并伴有明显的细胞凋亡出现，实验组caspase-3的相对活性明显高于正常细胞对照组和pcDNA31对照组；而caspase-8的活性没有明显变化。这一结果说明，apoptin基因诱导肿瘤细胞凋亡与caspase-3的激活有关，但apoptin是不通过哪个途径激活caspase-8来激活caspase-3的。由于caspase家族的一些成员可通过级联反应相继活化，最终诱导细胞凋亡。因此，apspase诱导A375细胞凋亡过程中，是否通过激活caspase-9来活化caspase-3，值得进一步探讨。
文献
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