解脲脲原体对氟喹诺酮类药物耐药性研究
【关键词】 解脲脲原体；氟喹诺酮；最小抑菌浓度；gyrA耐药基因
摘要： 目的 探讨解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药状况与gyrA基因突变之间的关系。方法 对鉴定确认的解脲脲原体临床分离株，采用微量肉汤稀释法检测其环丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星的最小抑菌浓度（MIC），随机抽取28株菌株，PCR扩增gyrA基因并测序，采用Blast比对法分析临床菌株与标准菌株的序列差异。结果 解脲脲原体的环丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星MIC50分别为8，4和2mg/L；MIC90分别为64，16和8mg/L；在28株解脲脲原体菌株中，经测序分析发现gyrA基因3种突变形式：(1)101位丙氨酸改变为缬氨酸；(2)112位天冬氨酸改变为谷氨酸；(3)267位碱基T缺失。具有基因突变的菌株其MIC明显高于没有突变的菌株。结论 江苏省部分地区解脲脲原体对第1、2代氟喹诺酮类药物耐药严重，此类药物不再适用于解脲脲原体感染；解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药主要是由于gyrA基因突变导致相应氨基酸改变所介导。
关键词： 解脲脲原体；氟喹诺酮；最小抑菌浓度；gyrA耐药基因
Study on fluroquinolones resistance and GyrA resistance gene mutation of ureaplasma urealyticum
Abstract： Objective To study the status of fluoroquinolones resistance and GyrA gene mutation of U.urealyticum.Methods In vitro susceptibilities (Minimum inhibitory concentration,MIC) to ciprofloxacin,ofloxaxin and levofloxacin of 84 U.urealyticum strains from clinical patients were determined by a broth microdilution method.Specific fragments of gyrA genes of randomly selected 28 strains were amplified by PCR and sequenced.Blast program was used to analyze and compare the sequence of clinical isolates with standard strain T3.Results For U.urealyticum the MIC50 of ciprofloxacin,ofloxacin and levofloxacin were 8,4 and 2mg/L respectively;Their MIC90 were 64,16 and 8mg/L respectively.Three alterations of GyrA in 28 U.urealyticum strains were found:(1)A alanine to valine substitution at position 101;(2)A aspartic acid to glutamine substitution at position 112;(3) An absence of T base at position 267.U.urealyticum with GyrA alterations was more resistant to fluoroquinolones.Conclusion Most of U.urealyticum isolated from Jiangsu province are resistant to ciprofloxacin,ofloxacin,and levofloxacin,and these three antibiotics should not used to treat infection of U.urealyticum.Resistance of U.urealyticum to fluroquinolones is mainly due to alterations of GyrA.
Key words： ureaplasma urealyticum；fluoroquinolones；minimum inhibitory concentration (MIC)；gyrA resistance gene
解脲脲原体（Ureaplasma urealyticu，Uu）是导致男女泌尿生殖系统感染的主要病原之一。与其他各种导致感染性疾病的病原微生物一样，Uu对各种抗生素也产生了耐药性，且耐药现象日益严重。氟喹诺酮类药物是治疗支原体感染的三大类抗生素之一，随着环丙沙星等的广泛使用，已发现Uu逐渐对其产生了耐药性。为了解目前Uu对氟喹诺酮类药物的耐药状况及其gyrA基因的突变情况，我们对江苏省部分地区分离的Uu临床菌株进行了实验研究。结果报告如下。
1 材料与方法
11 菌株来源 84株Uu分离自南京市某妇产科就诊者和南京市、南通市疾病预防控制中心性病皮肤病门诊就诊者。采用支原体ID试剂（法国生物梅里埃公司）分离培养，并经022μm滤膜过滤培养和特异性PCR检测等进行鉴定确认。
12 Uu对氟喹诺酮类药物的敏感性试验 采用微量肉汤稀释法测定环丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星等3种抗生素（江苏省药品检验所）测定Uu临床分离菌株的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）〔1〕。质控菌株为Uu T3标准菌株。若T3标准菌株的最小抑菌浓度(MIC)在质控范围内，且各阳性对照孔变红、抗生素对照及阴性对照孔不变色，则认为实验有效，记录被测菌株的MIC结果。
13 gyrA耐药基因的检测和序列分析 取阳性培养物200μl，离心15000r/min,5min，弃上清液。加裂解液A50μl、裂解液B2μl，混匀后置入55℃水浴1h，并置入95℃水浴5min。10000r/min,离心30s，上清液即为扩增的模板液。采用gyrA耐药基因检测试剂盒（无锡克隆遗传技术研究所）进行gyrA基因特异片段的PCR扩增，其正向引物序列为5′TTG CTG CTT TCG AAA ACG G3＇，反向引物序列为5＇CTG ATG GTA AAA CAC TTG G3＇，DNA片段为336bp。扩增程序为94℃预变性5min，然后按94℃ 20s→57℃ 30sec→72℃ 60s共循环35周期，最后72℃延长5min。对扩增产物进行电泳检测，gyrA基因检测阳性时将剩余的扩增产物送交上海生工公司进行测序，测序引物为PCR正向引物。
14 统计分析 采用SAS81统计软件进行两样本t检验，分析gyrA基因突变组与未突变组间氟喹诺酮类药物的MIC差异，采用Fisher精确概率法比较对环丙沙星不同敏感程度菌株之间的gyrA基因突变检出率。
2 结果
21 Uu对氟喹诺酮药物的敏感性（表1） 药敏实验结果显示，所分离的Uu临床菌株对环丙沙星的耐药性最高（5952%），对左旋氧氟沙星和氧氟沙星的耐药性也达40%以上。
表1 氟喹诺酮药物对解脲脲原体的MIC及解脲脲原体的耐药状况（略）
22 Uu菌株的gyrA耐药基因检测结果 分层随机抽取的28株菌株中，经测序分析发现，gyrA基因出现3种突变形式，即302位碱基C→T使101位丙氨酸改变为缬氨酸、336位碱基C→A使112位天冬氨酸改变为谷氨酸和267位碱基T缺失。
表2 gyrA基因突变与氟喹诺酮类抗生素MIC（mg/L）水平的关系（略）
23 gyrA基因突变与Uu氟喹诺酮类耐药性的关系(表2) 具有基因改变的菌株其氟喹诺酮类药物MIC几何均数明显高于没有突变的菌株。环丙沙星耐药组gyrA基因突变率为7059%（12/17），显著高于中敏组的25%（1/4）和敏感组（0/7）（fisher精确概率P=00030）。
3 讨论
氟喹诺酮类药物因其抗菌谱广且价格较低而广泛应用于临床，但病原体极易被药物诱导而产生耐药。本次研究测得的环丙沙星和氧氟沙星的MIC50均高于4mg/L，可见Uu对其敏感性已有明显下降。按照现有中报道的Uu对氟喹诺酮类药物的耐药标准〔2〕及支原体IST 2种商业试剂盒的药敏标准，本次检测的江苏省部分地区Uu临床分离株对氟喹诺酮类耐药率均高于40%，其中对环丙沙星耐药率达60%，与国内其他研究结果基本一致〔3，4〕，因此，此类氟喹诺酮类药物不再适用于Uu感染。支原体属对氟喹诺酮类药物的耐药机制被认为是由于药物靶位DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ特定区域的改变而引起，而导致酶特定区域氨基酸改变的分子基础是编码酶的基因突变。编码DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因分别为gyrA和parC基因，基因上的一段与氟喹诺酮类耐药相关的核苷酸序列被称为喹诺酮耐药决定区（QRDR）〔5-7〕。本研究发现，gyrA基因出现302位碱基C→T和336位碱基C→A的突变，分别导致101位丙氨酸改变为缬氨酸和112位天冬氨酸改变为谷氨酸；同时还发现2株菌株存在gyrA基因267位碱基T的缺失。在这3种改变中，以112位天冬氨酸改变为谷氨酸最多，与文献报道一致〔6，7〕；而101位丙氨酸改变为缬氨酸和267位碱基T缺失尚未见报道，我们已在美国生物基因库（GenBank）中登录（注册号：DQ683565）。研究还显示，在敏感菌株没有发现gyrA基因突变，具有基因突变的菌株其氟喹诺酮类药物的MIC明显高于没有突变的菌株，进一步证实了氟喹诺酮类的耐药主要是由gyrA基因突变导致的氨基酸改变所引起。
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