杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型
【摘要】 目的 研究杭州部分地区甲型副伤寒暴发与散发分离菌株的分子流行病学关系及菌株耐药状况。方法 对2002～2005年杭州地区L县和X区5起暴发疫情和10起散发病例的分离菌株，采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法进行分子分型，采用纸片法（K－B法）测定2种分离株的抗生素敏感性。结果 分离自2个地区的15株菌株被分为A、B、C、D共4 型，A、B、C等3个型密切近缘，同属一个克隆系。L县2005年7月和8月2起暴发菌株和8月3株散发菌株的PFGE型别均属B型，X区2004年12月和2005年9月的2起暴发菌株和9，10月的6株散发菌株的PFGE型别同属C型。4个型别的菌株对复方磺胺甲唑和利福平均100%耐药, 对头孢唑啉、头孢曲松、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃唑酮均敏感, 对氨苄西林、多西环素和四环素等不同程度耐药。结论 除1株散发菌株外，2002～2005年分离自杭州L县和X区的甲型副伤寒病原菌属于同一克隆系。散发病例可能均属于暴发流行后的散发流行。
【关键词】 甲型副伤寒沙门菌
脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis, PFGE)分型为一种重复性好、分辨率高的细菌分子分型方法，被广泛应用于细菌感染的分子流行病学研究。近年来，杭州地区发生多起甲型副伤寒暴发疫情，部分地区反复多次发生，已成为严重的公共卫生问题。本文应用PFGE分型技术分析了2002～2005年杭州地区5起暴发疫情和10起散发病例的分子流行病学特征，并进行抗生素敏感性观察。现将结果报告如下。
1 对象与方法
1?1 菌株来源与鉴定 收集2002～2005年杭州市L县和X区甲型副伤寒患者血培养及粪便中分离的甲型副伤寒沙门菌171株，其中分离自L县3起暴发疫情103株，散发病例3株；分离自X区2起暴发疫情58株，散发病例7株。菌株均由杭州市疾病预防控制中心微生物检验科依据GB 16001-1995进行鉴定。鉴定试剂：肠杆菌科鉴定试条ATB ID32E(法国生物梅里埃公司)；沙门菌诊断血清（成都生物制品所、兰州生物制品所），均在有效期内使用。
1?2 方法
1?2?1 仪器与试剂 (1)主要仪器：CHEF DRII 脉冲场电泳仪、BioRad凝胶图像分析系统、BioRad紫外分析仪(美国BioRad公司)。(2)主要试剂：蛋白酶K（上海Sangon公司）；XbaI(日本TaKaRa公司)；Seakem Gold琼脂糖(美国Cambrex公司)、0?5×TBE(自行配制)；Marker沙门菌Braenderup血清型H9812株（疾病预防控制中心惠赠）。
1?2?2 药物敏感性试验 选择14种抗生素，采用WHO推荐的改良Kirby-Bauer纸片法进行药物敏感试验。14种抗生素药敏纸片、Mueller-Hinton琼脂(杭州微生物试剂厂)，均在有效期内使用。结果判定参照卫生部制定的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》（WS/T 125-1999）。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923，均为本实验室保存。
1?2?3 PFGE分型 从每起暴发疫情分离菌株中各选择1株以及散发病例分离株作为代表菌株，计15株；操作方法按照美国疾病预防控制中心PFGE标准方法〔1〕并略加改进：Luria-Bertani（LB）平板划菌37℃过夜,无纤维棉签沾取细菌到2?5ml细菌悬浮液A600比浊，吸光度1?2～1?4之间。于400μl菌液加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)，再与等体积的预熔1%Seakem Gold琼脂糖:1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液混匀后，制备琼脂块。用50μg/ml蛋白酶K液消化2h。分别用15ml双蒸水和TE洗2和4次，消化和洗涤均在54℃摇床170r/min中进行。然后切胶至1?5ml PE管中，于37℃水浴中以25U XbaI酶切2h。将胶条包埋于1%Seakem Gold琼脂糖〔0?5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液〕。CHEFOⅡ电泳仪电泳19h,脉冲电泳起始转换时间为2?2s、最后转换时间为63?8s、电压为6V/cm、角度120°，电泳液为0?5×TBE缓冲液，电流控制在140mA左右，电泳缓冲液温度保持在14℃。溴化乙锭染色，凝胶图像分析系统保存结果。分型判别标准：按判别标准〔2〕, 酶切后图谱完全一致,判定为同一型；酶切后图谱有1～3条条带不同者，判定为菌株间关系较密切；酶切后图谱如有3条以上条带不同者，则判定为菌株间关系不密切。同时采用Dice相似性系数评估PFGE图谱间的相似性〔3〕，应用Quantity one软件电泳条带分子量。
2 结果
2?1 PFGE分型 分型结果可见，15株甲型副伤寒沙门菌分别产生19～20条条带，可分为A、B、C、D等4种型别,带型变化分别发生在651?1，401?6，327?5，74?6，41?1Kb处，4型之间分别有1～4 条电泳条带的差异（图1）。
M：Marker(XbaI 酶切H9812株)；1：A型；3～7：B型；2,8,9,11～15：C型；10：D型
图1 15株甲型副伤寒沙门菌PFGE分型图谱（略）
其中分离自2002年3月L县1起暴发疫情的菌株为A型；分离自2005年7月、8月L县2起暴发疫情以及2005年8月该县3起散发病例菌株为B型；分离自2004年12月、2005年9月X区2起暴发疫情以及2005年9，10月该区6起散发病例的菌株为C型；分离自2005年9月X区1起散发病例的菌株为D型。4型菌株之间的Dice系数分析表明,除分离自X区2005年的1株散发菌株外(D型)，其他14株菌株间PFGE型别的Dice系数均>0?9。
2?2 抗生素敏感性比较 4个型别的甲型副伤寒沙门菌对头孢唑啉、头孢曲松、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃唑酮均敏感（100%），对复方磺胺甲唑和利福平均100%耐药。其中94株A型菌株对多西环素耐药率为6?7％，对四环素耐药率为0，对氨苄西林耐药率为100％；12株B型菌株对多西环素和四环素耐药率均为0，对氨苄西林耐药率为16?7％；64株C型菌株对多西环素耐药率为20?3％，对四环素耐药率为4?7％，对氨苄西林耐药率为14?1％；1株D型菌株对多西环素和四环素耐药率均为0，对氨苄西林耐药率为100％。
3 讨论
本文结果显示，除分离自X区2005年的1株D型散发菌株外，其他14株菌株间PFGE型别的Dice系数均>0?9，表明2个地区的暴发或散发疫情分离到的甲型副伤寒沙门菌株关系密切，同属一个克隆系。其中占比例较大的A型与C型分别与朱水荣等〔4〕2001～2004年分离自临安与义乌、常山与温岭等地菌株的PFGE分型一致，表明杭州地区2002～2005年分离自L县和X区的流行菌株与浙江省其他地区的流行菌株也存在密切关系。本文结果显示，分离自L县2005年7月和8月的2起暴发疫情和同年8月的3起散发病例菌株的PFGE图谱完全一致，同属B型；分离自X区2004年12月和2005年9月的2起暴发疫情和2005年9月和10月的6起散发病例菌株的PFGE图谱完全一致，同属C型。提示暴发菌株与散发菌株间均呈现极为紧密关系，从发病时间推测，散发病例可能均属继当地暴发流行后的散发流行，其传染源可能与暴发传染源相同，即导致暴发的传染源可能未完全被发现或消毒不彻底；或者直接源自暴发病例或带菌者。同时，杭州地区已经开始有多重耐药的甲型副伤寒沙门菌菌株出现，应加强菌株耐药性的监测，根据药敏结果来指导临床用药和接触人群的预防性用药，从而更有效地防治甲型副伤寒。
【】
〔1〕 Centers for Disease Control and Prevention.Standardized laboratory protocol for molecular subtyping of escherichia coli O157:H7,non-typhoidal salmonella serotypes,and shigella sonnei by pulsed field gel electrophoresis(PFGE)［S］.Pulse Net,the National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance.,Atlanta Ga:Centers for Disease Control and Prevention,2004:24-28.
〔2〕 Tenover FC,Arbeit RD,Goering RV,et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electhophoresis:criteria for bacterial strain typing［J］.Clin Microbiol,1995,33(9):2233-2239.
〔3〕 Thong KL,Cordano AM,Yassin RM,et al.Molecular analysis of environmental and human isolates of salmonella typhi［J］.Applied and Environmental Microbiology,1996,62(1):271-274.
〔4〕 朱水荣,褚佩英,张政，等.脉冲场凝胶电泳与质粒图谱分析应用于浙江省甲副伤寒菌株的分子流行病学调查［J］.疾病监测,2005,20(9):463-466.
