霍乱弧菌2种核糖体分型方法比较

【关键词】  分型方法

　　目前分子杂交技术已广泛用于霍乱弧菌检测中，是霍乱疫情中追踪传染源的主要检测方法之一〔1〕。本文以16S-23S-5S rRNA为探针，对霍乱疫情中分离的霍乱弧菌进行Southern杂交后，使用2种限制性内切酶普通变形杆菌Ⅱ型酶（PVU Ⅱ）和大肠埃希菌R I型酶(ECORⅠ)，对2种核糖体分型（RT）方法的图谱进行分析比较。现将结果报告如下。

　　材料与方法 

　　（1）菌株来源：暴发疫情分离株27株，先后分离自本市2004年2起霍乱疫情，其中11株来自食用某快餐公司盒饭引起腹泻的11例患者粪便标本，4株为该快餐公司的盒饭加工环境涂抹标本；7株分离自某养殖场消毒前养殖水标本，5株为该养殖场消毒后养殖水标本。散发病例分离株3株，1999年2株，2001年1株。（2）试剂与仪器：培养基、霍乱诊断血清和噬菌体生物分型试剂(疾病预防控制中心)；限制性内切酶PVU II、ECORⅠ，16S-23S-5S rRNA基因探针和染色体DNA提取试剂盒（美国杜邦公司）；Riboprinter Microbial Characterization System（美国杜邦公司）。（3）菌株常规鉴定：〔2〕。（4）分型方法比较：2种RT方法按美国杜邦公司提供的仪器和试剂盒说明书进行。染色体DNA分别经ECORⅠ、PVU II酶切，16S-23S-5S rRNA基因探针杂交后，根据杂交条带的数目和片段大小的差异，判断RT结果。

　　结果 

　　（1）血清学和噬菌体生物分型：30株分离株均为01群霍乱弧菌，其中分离自腹泻患者及盒饭加工环境的15株霍乱弧菌，血清学分型均为01小川型，噬菌体生物分型为221和91；分离自消毒前养殖水标本的7株，血清学分型均为01稻叶型，噬菌体生物分型5f、1e和1f，分离自消毒后养殖水标本的5株，血清学分型均为01小川型，噬菌体生物分型1e和1f；散发株中，1株为01小川1b(1999),1株为01稻叶1d(2001)，1株为01稻叶8k(1999)。（2）2种核糖体分型：①ECORⅠ分型：30株01群霍乱弧菌经ECORⅠ分型,得到2个型,分别为RT5,29株(条带拷贝分别为102，26,40kb)；RT6,1株(条带拷贝分别为102，13，26，40kb)。分离自腹泻患者的15株和消毒前后养殖水的12株均为RT5，1999年的2株散发分离株分别为RT5和RT6，2001年的1株散发株为RT5。②PVU II分型：30株01群霍乱弧菌经PVU II分型，得到4个型，分别为 RT1，15株（条带拷贝分别为60，68，94，130，325kb）；RT2，11株（条带拷贝分别为60，68，90，100，150，325kb；RT3,3株（条带拷贝分别为60，64，90，100，141，220，325kb）；RT4，1株（条带拷贝分别为60，70，75，90，100，125，141，325kb）。分离自腹泻患者的15株均为RT1，分离自消毒前养殖水的7株中6株为RT2，1株为RT3；分离自消毒后养殖水的5株均为RT2。1999年2株散发株为RT3和RT4，2001年散发株为RT3。③2种方法比较：用PVU II对菌株分型，得到4个RT型，其中快餐盒饭疫情分离株虽然血清学和噬菌体生物分型为01小川22l和9l，但RT分型均为RT1，表明这15株菌属同一克隆体系，而与RT2、RT3 和RT4等菌株亲源关系较远，提示该起疫情可能与快餐公司盒饭污染密切相关。而分离自消毒前养殖水的6株和消毒后的5株，虽血清噬菌体生物分型分别为01稻叶型5f、1e、1f和01小川型1e和1f，但RT分型均为RT2，表明这11株属同一克隆体系，而与RT1、RT3 和RT4等菌株亲源关系较远，提示该起疫情养殖水中的霍乱弧菌可能因消毒剂作用其血清型已发生变异，可排除消毒后养殖水二次污染的推断。消毒前养殖水中有1株为血清学和噬菌体生物分型为01稻叶1e，RT分型为RT3，而消毒后的5株菌为RT2，提示RT3型霍乱弧菌可能在消毒时已被杀灭。1999和2001年的散发分离株中存在RT3型，养殖水中12株分别为RT2和RT3，从时间上先有RT3，而RT2是否为RT3突变而来，还有待深入研究。

　　讨论 

　　目前国内外有关霍乱弧菌RT分型的报道〔3-6〕较多，但RT结果受基因探针来源与长度、电泳条件及分型标准等诸多因素影响，并且RT分型方法和分型标准尚未规范。本文应用杜邦公司的 Riboprinter Microbial Characterization System进行RT分型，结果令人满意，可对今后霍乱弧菌RT分型方法的统一规范提供借鉴。Riboprinter Microbial Characterization System不足之处是试剂昂贵，建议试剂逐步国产化，降低试验成本，使该系统更好的为霍乱防制工作服务。ECORⅠ分型得到2个RT型，其中29株均为RT5，1株为RT6；1999年分离出RT5和RT6，2001年分离出RT5，2004年2起不同时间、不同地点的暴发疫情分离株均为RT5，表明该结果不能为追踪传染源控制疫情提供较好的实验室诊断依据。

　　〔1〕  Karaolis D K R,Lan R,Reeves P R.Molecular evolution of the seventh-pandemic clone of vibrio cholerae and its relationship to other pandemic Vibrio cholerae isolates［J］.J  Bacteriol，1994，176:6199-6206.

　　〔2〕  中华人民共和国卫生部疾病预防控制司.霍乱防治手册［M］.5版.北京：卫生部，1999：81-83，51-64.

　　〔3〕  Bhanumathi R，Sabeena F，Lsac SR，et al.Characterization of a toxigenic vibrio cholerae 0139 Strains belonging to a new ribotype and isolated from a diarrheal patient［J］.J  Clin Microbiol，2002，40（12）：4779-4781.

　　〔4〕  刘红露，罗隆泽，冯泽惠，等.四川省2001年霍乱病的分子流行病学特征［J］.预防医学杂志,2003，4（增刊）：155-156.

　　〔5〕  严寒秋，李峰，黎新宇，等.北京市1998-2000年01群霍乱弧菌分子流行病学研究［J］.中国预防医学杂志,2005，6（增刊）：28-29.

　　〔6〕  芮勇宇,蔡初的.16SrRNA基因探针与ctxA基因探针用于霍乱弧菌分型［J］.中国公共卫生，2000，16（11）：1018-1019.