人白介素?12植物表达载体的构建

【摘要】  　　目的： 构建人白介素?12(hIL?12)基因的植物表达载体. 方法： 采用PCR技术从质粒pCA13?hIL?12中扩增hIL?12基因，SmaI， SacI分别酶切hIL?12基因和植物表达载体pBI121，回收，T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121?hIL?12，双酶切和DNA测序鉴定后，通过三亲杂交法将表达载体pBI121?hIL?12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101，用PCR法进行鉴定. 结果： 双酶切及DNA序列测定证实hIL?12已插入到表达载体pBI121中，PCR 扩增表明构建的重组表达载体pBI121?hIL?12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中. 结论： 成功构建了植物表达载体pBI121?hIL?12，为进一步利用转基因植物生产hIL?12奠定了实验基础.

【关键词】  人白细胞介素?12 植物表达载体 载体构建 根瘤菌属

    0引言

　　人白细胞介素?12(hIL?12)能促进杀伤细胞（NK）和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用，诱导γ干扰素的产生，调节Th0细胞向Th1细胞分化增殖，增强细胞免疫等多种生物学活性［1］，在机体的抗肿瘤、抗病毒、抗过敏过程中发挥极其重要的作用［2］. 自然状态下, 体内IL?12含量低，获得较困难. 我们构建hIL?12基因的植物表达载体，为利用植物基因工程技术生产hIL?12基因进行前期准备工作.

    1材料和方法

    1.1材料大肠杆菌菌株DH5α,含人IL?12的质粒pCA13?hIL?12由遵义医学院生物化学与分子生物学实验室保存；植物表达载体pBI121由浙江大学馈赠；根癌农杆菌EHA105，GV3101以及辅助质粒pRK2013由华南热带农业大学国家重点实验室馈赠. 限制性核酸内切酶（SmaI， SacI），T4DNA连接酶（美国Promega公司）；高保真即用PCR扩增试剂盒、UNTQ?10柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程公司）；化学试剂均为国产分析纯.

    1.2方法

    1.2.1hIL?12引物的设计上游引物GenBank中cDNA序列进行设计，由上海生工生物工程公司完成，即5′?TCC CCC GGG CCA CCA TGG GTC ACC AGC A?3′，其中CCC GGG为SmaI酶切位点；下游引物5′?A CCG GAG CTC TTA GGA AGC ATT CAG ATA G?3′，其中GAG CTC为SacI酶切位点.

    1.2.2PCR扩增hIL?12基因在0.2 mL Eppendorf管中加入上、下游引物各3 μL，模板pCA13?hIL?12 1 μL，2×PCR Master 25 μL，补去离子水至50 μL. 扩增条件为94℃ 10 min，94℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃ 2.5 min，30个循环，72℃延伸10 min. 扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离，将1600 bp左右的目的片段回收纯化.

    1.2.3重组质粒pBI121?hIL?12 的构建和鉴定PCR产物纯化回收后与载体pBI121经限制性核酸内切酶（SmaI， SacI）双酶切，取回收的PCR产物和载体大片段以浓度比3∶1，16℃连接过夜. 转化感受态DH5α细胞，涂布于100 mg/L卡那霉素抗性琼脂平板，挑选阳性克隆，碱裂解法小量提取重组质粒，作SmaI，SacI双酶切鉴定，并送上海生工生物工程公司进行测序鉴定［3］. 构建的重组载体见图1，其中hIL?12由P35，P40两亚基的基因经Linker序列连接得到.

    图1表达载体pBI121? hIL?12示意图

    1.2.4pBI121? hIL?12转化根癌农杆菌采用三亲杂交法：受体菌、供体菌及辅助转移菌分别于3 mL含相应抗生素的LB培养基中培养过夜（受体菌，28℃；其余两种37℃过夜培养），按1∶1∶1的比例混合后，取50 μL涂布在无抗生素的LB平板上，28℃，过夜培养，待长出菌落后涂布相应的选择平板（含50 mg/L卡那霉素、100 mg/L利福平、50 mg/L链霉素），待长出后，挑单菌落重新在相应的选择平板上进行纯化，挑出纯化后的单个菌落在相应抗性LB液体培养基中28℃，过夜培养，用于鉴定. 

    1.2.5转化农杆菌的PCR鉴定采用［4］的方法分别提取农杆菌（EHA105，GV3101）中的mini?Ti质粒，用预先设计的引物进行PCR扩增鉴定，获得可用于遗传转化的农杆菌.

    2结果

    2.1PCR方法获取hIL?12基因片段以质粒pCA13?hIL?12为模板，运用PCR方法获得全长hIL?12基因（1613 bp，图2）.

    2.2重组质粒pBI121?hIL?12的鉴定经限制性内切酶SmaI，SacI酶切后得到大小约1600 bp和12800 bp的大片段，表明hIL?12已经克隆到质粒pBI121中（图3）. 质粒送上海生工生物工程公司进行全长测序鉴定，通过序列比对分析发现，目的基因与GenBank中已发表的基因序列完全一致，表明植物表达载体pBI121?hIL?12构建成功.

    2.3转化农杆菌的PCR检测从三亲融合后的农杆菌中提取mini?Ti质粒，进行PCR扩增，扩增出大小约1600 bp的片段，与来自大肠杆菌DH5α中的重组质粒pBI121?hIL?12为模板的PCR产物一致，而对照空载根癌农杆菌单菌落为空白，表明获得了2种含hIL?12基因的植物表达载体的农杆菌（图5）.

     3讨论

    hIL?12是相对分子质量为75 ku的蛋白质，由不同基因编码的2个亚基P35与P40两条肽链通过二硫键结合在一起的异二聚体，研究表明，细胞必须同时表达这两个基因才能产生有活性的IL?12. 我们选用的质粒pCA13?hIL?12中的hIL?12基因就是利用这两个亚基具有独立的基因序列特点，将hIL?12两个亚单位进行融合，中间插入一个Linker序列，以保证其基因产物具有正确的蛋白结构及等比例的表达.

    实验中选用的载体pBI121是一个常用的植物表达载体，多克隆位点上游带有CaMV35S启动子，在植物组织中能启动外源基因的表达，下游带有GUS报告基因，由于酶切位点的要求，本实验的GUS已被切除，切除了GUS报告基因，给转化子的筛选带来了不便，但这一缺憾可以通过特异性引物进行PCR检测来弥补；在NOS启动子下游带有NPTII基因，可进行Kanamicin抗性筛选.

    Mason等［5］提出了利用植物作生物反应器生产口服疫苗的设想. 我们构建的植物表达载体pBI121?hIL?12，可以用于马铃薯、烟草、番茄等植物的转化，从而为用植物作为生物反应器生产药用蛋白提供实验基础. 目前，将hIL?12基因转入马铃薯的工作正在进行中. 我们成功构建了hIL?12基因的植物表达载体，为最终实现用植物生产hIL?12奠定了基础.

【文献】
  ［1］ Hirota T, Suzuki Y, Hasegawa K, et al. Functional haplotypes of IL?12B are associated with childhood atopic asthma ［J］. J Allergy Clin Immunol, 2005,116(4):789-795.

［2］ Inoue Y, Nakayama Y, Minagawa N, et al. Relationship between interleukin?12?expressing cells and antigen?presenting cells in patients with colorectal cancer ［J］.Anticancer Res, 2005,25(5):3541-3546.

［3］ 李霞，张璟，苏金，等. 人cbl基因真核表达载体的构建及表达［J］. 第四军医大学学报，2004, 25(24):2209-2211.

［4］ 王关林，方宏筠.　植物基因工程［M］. 第2版，北京:出版社,2002:739-740.

［5］ Mason HS, Lam DM, Arntzen CJ. Expression of Hepatitis B Surface Antigen in Transgenic Plants ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:11745-11749.