长期摄入含贫铀的饲料对雄性大鼠的遗传毒性研究
作者：李蓉，冷言冰，艾国平，徐辉，粟永萍，程天民
【摘要】 目的: 大鼠长期食入一定剂量的贫铀后是否会产生遗传毒性. 方法： 给予初断乳大鼠含贫铀饲料，摄入的剂量分别为0，0.4，4，40 mg/（kg·d），4 mo后，观察亲代（F0代）和子代（F1代）大鼠精子畸形率，骨髓细胞微核率的改变，用单细胞凝胶电泳法研究贫铀对精子DNA的损伤程度. 结果： 摄入小剂量贫铀的F0代大鼠精子畸形率和彗星细胞的各指标与正常组差异无统计学意义（P>0.05）. 但中、高剂量组F0和F1代的精子畸形率、骨髓细胞微核率和彗星细胞率均增加（P<0.01），并与摄入贫铀的剂量和摄入时间呈一定的相关关系. 结论： 长期摄入一定剂量的贫铀可对大鼠产生遗传毒性.
【关键词】 贫铀
0引言
贫铀(depleted uranium, DU)是铀浓缩加工成核燃料过程中所产生的副产品，已广泛应用于民用和军事领域. 从1991年的海湾战争开始，及后来的几次局部战争中，贫铀武器被大量使用，造成环境大面积污染［1-2］. 近年来，我国核及核电站建设不断，贫铀废料增多，在铀再处理厂和铀作业实际环境也存在贫铀污染问题. 贫铀污染涉及的居民人数多，影响面广，长期摄入导致体内蓄积的量较大，因此，贫铀对环境的污染及对机体的影响是一个新的值得关注的问题. 长期食入被贫铀污染的食物和饮水后，对机体产生何种损害作用，目前几乎没有报道. 因此，我们对雄性大鼠长期给予含一定剂量的贫铀饲料，观察贫铀对遗传物质的损伤，评价贫铀遗传毒性效应，对其长期危害进行初步研究.
1材料和方法
1.1材料取初断乳Wistar大鼠，体质量35~55 g，雌雄各150只，将DU混合入饲料喂食乳鼠，分为小、中、高剂量组，摄入贫铀的剂量分别为0.4，4，40 mg/(kg·d）. 另设正常组20只，摄入普通饲料. 大鼠由第三军医大学大坪动物研究所提供【SCXK（渝）2002003】. 贫铀饲料的制备方法为：将DU片（铀同位素组成： 238U占99.75%， 235U占0.2%以及痕量234U），加入少量浓硝酸，微热至溶解成黄色液体，用双蒸水稀释至适当体积，加入饲料粉中，搅拌均匀，加工成型，晒干.
1.2方法
1.2.1DU食入染毒模型的建立乳鼠摄入贫铀，生长至4 mo左右，至性成熟期，每组雌雄大鼠各取25只，按照雄雌1∶1同笼，直到受孕取出单独饲养，或进行21 d为止. 每日18：00点同笼，次日早上检查阴拴，确定并记录受孕日期. 亲代大鼠（F0）所生仔鼠为第一代（F1）. 对F1大鼠继续喂饲贫铀饲料，直至性成熟期，与F1代同样摄入贫铀饲料的雌鼠交配，产下F2代. 下述实验均在大鼠生长至4 mo时进行.
1.2.2大鼠精子畸形试验处死大鼠，取双侧附睾，放入3 mL生理盐水中，剪碎，吹打，静置，过滤，吸取精子悬液滴于载玻片上，均匀推片，晾干，甲醇固定5 min，干燥后20 g/L伊红染液染色1.5 h，高倍镜下观察精子形态，每只大鼠检查完整精子300条，每个组至少检查1000条精子，精子畸变率.
1.2.3大鼠骨髓微核（micronuclei，MN）试验取双侧股骨，抽吸胎牛血清冲洗骨髓腔，制备骨髓细胞悬液. 1000 r/min离心5 min后，弃上清，加入等体积血清，吹打. 在玻片滴一滴（5~8 μL）骨髓细胞悬液，推片，干燥，无水甲醇固定数分钟. 用姬姆萨染液室温下染色25~30 min后取出，磷酸缓冲液冲洗，显微镜下观察. 一只大鼠需观察1000~2000个细胞，每组计数5000个嗜多染红细胞（PCE）中带MN的出现频率. 计算微核细胞率（‰）和微核率（‰）.
1.2.4单细胞凝胶电泳或彗星电泳取双侧附睾，放入3 mL PBS缓冲液中，剪碎，过滤，制成细胞悬液. 用45℃, 100 μL 5 g/L正常熔点琼脂糖PBS凝胶浇注首层胶. 取0.1 mL浓度为106/mL的细胞悬液加入0.9 mL 37℃的低熔点琼脂糖PBS，混匀后速取75 μL加到第一层胶上，制备第二层胶. 将载玻片浸入4℃冷裂解液中5 h. 高pH碱性电泳缓冲液中浸泡20 min. 低温，300 mA，25 V，电泳30 min. 取出凝胶玻片，pH 7.5，0.4 mmol/L Tris浸洗，15 min×3次. 中和凝胶中的碱液，70 μL 100 mg/L EB溶液染色15 min. 激光共聚焦显微镜下观察.
统计学处理: 数据分析采用SPSS 12.0软件进行. 对组间精子畸形率和微核率比较采用非参数秩和检验，彗星电泳结果采用ANOVA分析.
2结果
2.1长期摄入贫铀的大鼠精子畸形率大鼠精子畸形以头体部为主，头部以无钩、无定形和香蕉头畸形居多（图1）. 小剂量组与正常组差异无统计学意义，F0代和F1代中、高剂量组均增高，且高剂量组高于中剂量组（P<0.01,表1）.
2.2长期摄入贫铀的大鼠骨髓细胞微核率摄入贫铀的大鼠与正常组比较微核率升高(图2)，中、高剂量组之间并无统计学差异，但F1代较F0代相应的组升高（表2）.
图1贫铀所致精子畸形的几种常见形式 略
表1大鼠精子畸形率比较(略)
图2大鼠骨髓嗜多染红细胞中的微核（略）
表2大鼠骨髓细胞微核率比较（略)
2.3长期摄入贫铀的大鼠精子彗星电泳在荧光显微镜下可看到呈桔红色的细胞核，损伤细胞产生的断裂DNA断片，向阳极端迁移并形成拖尾现象，形似彗星(图3). 精子彗星图像分析结果显示，小剂量组的各项指标与正常组差异无统计学意义，这与精子畸形率的结果是一致的. 其余实验组拖尾率和尾长显著升高，随着剂量和摄入时间增加，DNA损伤程度也越严重；彗星头部百分比显著下降，且各组之间有统计学差异. 表明贫铀对精子DNA的损伤程度随摄入剂量和摄入时间的增加而加重. 经拟合，在F0代，贫铀剂量与彗星细胞拖尾率之间的相关关系可用下列公式表示：Y=4.2013＋0.7045X-0.0138X2， R2=0.9855，其中Y表示彗星细胞拖尾率，X表示贫铀剂量，但该方程仅适合F0代.
图3食入贫铀的大鼠精子彗星细胞 略
表3大鼠精子DNA损伤分析(略)
3讨论
我们的研究结果表明，小剂量贫铀不会使大鼠精子畸形率显著增加，但中、高剂量组精子畸形率均显著高于正常组，且高剂量组高于中剂量组，说明只有达到一定剂量的贫铀才可使精子畸形率增加，且随贫铀剂量的增加而增加. 研究表明［3-5］，贫铀在人体中的主要靶蓄积器官包括肾脏和睾丸等. 吸入大剂量贫铀粉尘后，可引起动物睾丸损伤，重量减轻，精子数量降低，生精细胞脱落，各型生殖细胞不同程度的缺如，并伴有生精细胞凋亡率上升［6］. 雌性大鼠经手术植入DU片后，在怀孕20 d时，母鼠肾脏、胎盘和全胎儿的贫铀含量均明显增加，说明DU可通过母体对子代产生毒性作用［7］. 这些报道的多是急性较大剂量贫铀产生的损伤. 本研究是长期摄入一定剂量的贫铀，与这些报道的致伤条件不同，贫铀只有到达一定剂量才会引起精子畸形率显著增加. 对浓缩铀和天然铀的生殖遗传毒性进行研究发现，不同水平浓缩铀235UO2F内污染机体时，诱发的精子畸形主要呈现双头、双尾和无钩精子，并可致精子DNA断裂，随浓缩铀摄入量的增加而增加［8］. 国外学者［7］发现大鼠摄入一定剂量［（0~80 mg/（kg·d）］的硝酸铀酰，持续64 d，在所研究的任何剂量水平，睾丸功能和精子生成均未受影响；但雌鼠的妊娠率显著下降，但无剂量相关关系；这些变化可能是因雌鼠本身的妊娠率降低，或因醋酸铀酰处理64d后产生的行为学变化（包括动物性欲降低）而引起的妊娠率降低. 在铀矿工人中也发现染色体不稳定和激素水平的改变，男性铀矿工的后代中，女性后代比预期多，说明精子出现了潜在改变［7］.
评价遗传毒性在染色体水平的影响，微核是一个可靠方法. 长期摄入小剂量贫铀可使大鼠骨髓细胞微核率增加，但中、高剂量组之间并无统计学差异，F1代较F0代显著升高，说明长期摄入贫铀，其微核率与摄入的剂量之间并无显著的正相关关系，但在剂量相同的情况下，微核率随摄入时间的增加而增加. 这和报道一致，如Ihrulj等［9］认为在科索沃冲突中明显影响环境的遗传毒性物质是贫铀，也发现该地区贫铀暴露人群微核形成较对照人群增加，与年龄的相关性显著. 另外，在波赛尼亚等地，研究发现暴露于贫铀人员微核率较附近未受污染地区人员上升［10］. 对接触铀作业的工作人员的调查表明，铀的致癌效应可使染色体畸变率、姐妹染色体互换和微核检出率增加 ［7］. 因外周血淋巴细胞微核率和骨髓细胞微核率在放射事故确定受照剂量时，应用非常广泛，本研究结果可为进一步探索贫铀进入体内的剂量、摄入时间与微核率之间是否呈一定的相关关系打下基础.
彗星电泳实验表明，摄入贫铀对精子DNA的损伤程度随剂量和摄入时间的增加而加重. 吸入大剂量贫铀粉尘后，大鼠初级精母细胞染色体畸变率也有所升高，精子染色质结构试验各变量平均值均增高［6］. 国外学者［11］发现吸入暴露于DU，会导致支气管－肺泡管(BAL)细胞的DNA链断裂，DNA损伤是炎症和氧化应急的结果之一；彗星电泳实验揭示BAL 细胞的DNA损伤，部分是双链断裂，说明辐射可能会导致DU在体遗传毒性效应. 彗星电泳可以检测2 Gy以下照射对细胞的损伤与修复，并被认为是低剂量辐射（0.05 Gy）时快速灵敏的检测方法［12］. 故在本研究的基础上，可进一步探索彗星细胞与贫铀剂量之间的关系.
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