人DDR2基因pShuttle?CMV穿梭载体的构建及表达
【摘要】 目的：构建带有flag标签的人DDR2 pShuttle?CMV载体， 检测其真核表达并观察DDR2分子的亚细胞分布. 方法：以含有人全长DDR2 cDNA的质粒为模板，用PCR方法扩增DDR2基因的C?端（DDR2?C），并在其C末端带上含24 bp的flag标签，Nco I/EcoR V酶切后亚克隆入含有DDR2全长序列的pMD18?T载体，即替换掉原有DDR2序列的C?端，引入flag标签，测序正确后再克隆入pShuttle?CMV表达载体，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染HEK293细胞，Western Blot检测DDR2?flag在细胞中的表达. 瞬时转染Hela细胞，通过间接免疫荧光法观察DDR2分子在细胞内的分布情况. 结果：测序及酶切显示DDR2?flag/pShuttle?CMV载体构建符合预期；脂质体法转染HEK293细胞，24 h后用Western Blot方法检测到目的蛋白的表达；对转染了目的载体的细胞应用FITC标记的抗体进行间接免疫荧光实验，激光共聚焦显微镜观察到DDR2分子主要分布于细胞质与细胞膜. 结论：成功构建并表达了C?末端带flag标签的DDR2真核表达载体，使其在真核细胞中表达，并观察到其亚细胞分布.
【关键词】 聚合酶链式反应
0引言
盘状结构域受体2（discoidin domain receptor 2，DDR2）属于一种受体型蛋白酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)，可被天然纤维型胶原活化，从而介导基质金属蛋白酶（MMP?1，MMP?8，MMP?13）的表达［1-2］. DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)成纤维样滑膜细胞中呈高表达状态，并具有较高的磷酸化水平，而其所活化的下游分子中，特别是MMP?13对关节软骨的主要成分II型胶原的降解能力高于其他胶原酶，因此认为“Ⅱ型胶原?DDR2?MMPs”通路中的关键分子可能成为减轻RA关节软骨破坏的药物作用靶位［3］. 然而目前有关此通路的研究报道甚少，我们构建C?末端融合flag标签的人DDR2基因真核表达载体，旨在为进一步研究DDR2信号通路在RA中的影响奠定基础.
1材料和方法
1．1材料大肠杆菌菌株XL?10，pcDNA3.1(+)真核表达载体，含人全长DDR2 cDNA的质粒，HEK293细胞及Hela细胞由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存. dNTP，dATP，pfu高保真聚合酶，Taq DNA聚合酶，各种限制性内切酶，pMD18?T载体，T4 DNA连接酶，DL2000 DNA marker（日本TaKaRa公司）；DMEM 培养基（美国Gibco公司）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；抗flag M2 mAb（美国Sigma公司）；抗DDR2 抗体及FITC标记的羊抗鼠第二抗体（美国Santa Cruz公司）；Western Blot所用发光底物（美国Pierce公司），其他试剂均为国产分析纯. 用于PCR反应的引物由北京三博远志生物公司合成，质粒提取和DNA回收试剂盒由安徽优晶生物工程公司提供.
1．2方法
1．2．1引物设计DDR2?C上游引物序列：5′?GTC ACC ATG GAC CTG CTC TCA GG?3′， 其中CCA TGG为位于DDR2序列1631 bp处的Nco I 酶切位点；下游引物序列：5′?GAA TTC GAT ATC TCA CTT GTC ATC ATC GTC CTT GTA ATC CTC GTC GCC TTG TTG AAG GA?3′，GAA TTC为EcoR I 酶切位点，GAT ATC为EcoR V酶切位点，其中前者可用于将DDR2?C（含flag）的PCR产物克隆入pMD18?T载体，后者用于将带有flag标签的DDR2全长序列亚克隆入pShuttle?CMV载体，下划双线部分为编码flag标签的核苷酸序列.
1．2．2PCR扩增DDR2?C（含flag）基因及产物修饰扩增条件为94℃ 5 min，94℃ 40 s，55℃ 40 s, 72℃ 1 min，30个循环. 产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收后进行加“A”反应：72℃ 40 min.
1．2．3PCR产物克隆及序列测定加“A”后的PCR产物回收，克隆到pMD?18T载体，转化大肠杆菌XL?10感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定并测序.
1．2．4DDR2全序列拼接及鉴定用Nco I/EcoR I 双酶切DDR2?C/pMD?18T，得到含flag的DDR2C?端，置换出pMD18?T载体中不含flag标签的DDR2 C?端，并进行酶切鉴定，即在pMD18?T载体中完成含有flag的新DDR2全长序列的拼接.
1．2．5真核表达载体的构建用Hind III/EcoR V/Sca I三酶切含有拼接DDR2序列的pMD18?T载体，其中Hind III/EcoR V可切下完整的DDR2序列（2568 bp），Sca I将余下的pMD18?T载体(2692 bp)切割为两个小片段(924 bp+1768 bp)，便于电泳分离.
1．2．6基因转染HEK293细胞在含100 mL/L 新生小牛血清的DMEM培养基中，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度下培养，80％汇合时按照Lipofectamine2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染.
1．2．7Western Blot检测转染后细胞中目的基因的表达转染后24 h裂解细胞收集总蛋白，取20 μg处理后的蛋白样品进行SDS?PAGE电泳并电转移至NC膜，5 g/L脱脂奶粉封闭1 h，与适当稀释后的一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，与l∶4000稀释的FITC标记的二抗室温孵育l h，TBST洗膜后加入发光底物孵育1 min，X光片曝光，显影，定影.
1．2．8间接免疫荧光观察DDR2亚细胞定位Hela细胞在含100 mL/L新生小牛血清的DMEM培养基中，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度下培养，80％汇合时按照Lipofectamine2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染，于转染24 h后收细胞，40 mL/L多聚甲醛4℃固定15 min，10 mL/L TritonX?100室温孵育10 min，用含10 mL/L BSA的一抗（1∶100稀释）4℃过夜，FITC标记的二抗（1∶100稀释）室温孵育2 h，核染料PI 37℃孵育5 min，甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察.
2结果
2.1DDR2?C（含flag）片段的扩增、克隆及序列分析DDR2?C（含flag）的PCR产物为937 bp的特异性条带（图1A）. 测序结果经Blast分析表明，PCR扩增获得并克隆的DDR2?C片段序列完全正确. 通过位于片段内的BamH I与T载体多克隆位点处的Hind III进行双酶切，可切出预期大小的片段，分别为343，594，2692 bp的三条带（图1B）.
图1PCR产物及重组载体的鉴定 略
2.2DDR2全长片段的拼接拼接后的DDR2flag/PMD18?T用Nco I/EcoR V酶切，可见切出937 bp的目的片段（图2）.
图2DDR2flag/PMD18?T重组质粒的酶切鉴定 略
2.3DDR2flag/pShuttle?CMV真核表达载体的构建拼接成功后的DDR2flag片段经Hind III/EcoR V双酶切，回收2592 bp的片段连入真核载体pShuttle?CMV，用DDR2序列内部的两个BamH I 酶切位点鉴定，构建成功可见切出1029 bp的目的片段，反之则没有（图3）.
2.4真核表达载体DDR2flag/pShuttle?CMV在HEK293细胞中的表达构建成功的DDR2flag/pShuttle?CMV和空质粒pShuttle?CMV分别瞬时转染HEK293细胞，转染后24 h用抗flag抗体检测DDR2flag在蛋白水平的表达，而对照的空质粒转染后则没有相应的条带（图4）.
2.5DDR2的亚细胞定位将构建的重组表达载体DDR2flag/pShuttle?CMV瞬时转染Hela细胞，激光共聚焦显微镜可观察到作为膜受体的DDR2分子主要分布于胞膜及胞质近膜处，也发现其存在少量胞核分布（图5）.
图3－图5 略
3讨论
由于DDR2是RA病理进程中的关键分子，因此对其所进行的研究，无论是体内还是体外水平，都需要高表达且易于检测的工具载体. 我们构建的DDR2flag/pShuttle?CMV载体与以往工具载体的不同在于：一方面，它是腺病毒包装的穿梭载体，可用于DDR2相关腺病毒的包装，无论在RA滑膜细胞还是动物模型中都能达到一般真核表达载体所不具备的高转染/感染效率；同时其所携带的flag标签也大大提高了目的基因的检测灵敏性和特异性.
有研究发现 ［4-5］， DDR1在胶原刺激下与Src结合后发生自身磷酸化，继而被基质金属蛋白酶水解为氨基端外功能区及酪氨酸磷酸化的胞内羧基残段(CTF)，目前推测被剪切掉的胞外功能区可能有着竞争结合并中止胶原配体持续发挥作用的负反馈功能，但同属盘状结构域受体家族的DDR2存在此现象的报道尚少. 有趣的是， 我们在观察DDR2亚细胞定位时发现其存在少量胞核分布（图5C箭头所示）， 这提示， DDR2很可能与DDR1一样有着类似的限制性蛋白水解现象， 这也预示着DDR2除具有膜受体功能外， 在信号转导过程中可能还具有更为复杂的作用.
我们以含有人DDR2全长cDNA的质粒为模板，通过PCR法获得了C?末端融合有flag标签的人DDR2基因，并构建了DDR2?flag基因的真核表达载体，该表达载体在真核细胞HERK293中能够正确表达定位，这为进一步研究DDR2功能奠定了基础.
【文献】
［1］ Olaso E, Labrador JP, Wang L, et al. Discoidin domain receptor 2 regulates fibroblast proliferation and migration through the extracellular matrix in association with transcriptional activation of matrix metalloproteinase?2［J］. J Biol Chem, 2002, 277(5): 3606-3613.
［2］ Xu L, Peng H, Wu D, et al. Activation of the discoidin domain receptor 2 induces expression of matrix metalloproteinase 13 associated with osteoarthritis in mice［J］. J Biol Chem，2005,280(1):548-555.
［3］ Wang J，Lu H，Liu X，et al. Functional analysis of discoidin domain receptor 2 in synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis［J］. J Autoimmun，2002,19(3)：161-168.
［4］ Slack BE, Siniaia MS, Blusztajn JK. Collagen type I selectively activates ectodomain shedding of the discoidin domain receptor 1: Involvement of Src tyrosine kinase［J］.Cell Biochem, 2006,98(3):672-684.
［5］ Ebinu JO, Yankner BA. A RIP tide in neuronal signal transduction［J］. Neuron, 2002,34: 499-502.
