胰腺癌组织中神经生长因子受体的表达意义
【摘要】 目的： 研究神经生长因子（NGF）高亲和受体TrkA与低亲和受体p75在胰腺癌中的表达意义. 方法： 应用实时定量PCR法检测56例胰腺癌组织中TrkA及p75的表达并进行临床病理及预后分析. 结果： 所有组织标本中均可检测出TrkA及p75的表达呈负相关. p75与TrkA的表达水平与患者的腹背部疼痛和神经浸润程度有关 （P均<0.05）. Cox单变量分析揭示，高p75表达患者较高TrkA患者的总生存时间延长（P<0.05），Cox多变量分析揭示，p75及TrkA均为影响预后的独立因素. 结论： 胰腺癌中TrkA的表达促进肿瘤的恶性进展，而p75则相反，NGF刺激增长或抑制胰腺癌的双重作用可能与TrkA及p75的表达比率相关.
【关键词】 胰腺肿瘤；受体，神经生长因子；TrkA；p75
0引言
胰腺癌嗜神经浸润的生物学特征，是导致术后局部复发影响预后的主要原因之一［1-2］. 研究发现，神经生长因子（nerve growth factor， NGF）及其受体 TrkA（tyrosine kinase receptor A ）/ p75 (p75 neurotrophin receptor )在胰腺癌中具有诱导细胞凋亡、促进癌细胞分裂和存活的作用. 我们研究的目的是阐明TrkA与p75在胰腺癌中的表达意义.
1材料和方法
1.1材料2001?06/2005?12行标准胰十二指肠切除术胰腺癌标本56（男30, 女26）例, 年龄48～86（平均62）岁，病理检查证实为胰腺导管腺癌. 采用1987年国际抗癌联盟(UICC)的TNM分期标准,Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期37例；组织病分级，1级21例，2级30例，3级5例. 手术切除后立即切取标本,一半送病理诊断及神经浸润分析，按Zhu等［3］的方法：0，未见神经浸润；1，神经浸润少见，每张切片不超过1处；2，神经浸润很容易发现，每张切片2～4处；3，每张切片超过4处. 另一半快速液氮冷冻,-80℃保存以备检测TrkA及p75表达水平. 生存者中位随访时间为6 mo，出现远处转移48例. 所有患者术前按Zhu等［3］的方法结合视觉疼痛类比量表(visual analog scales, VAS)评分以评价患者腹部、背部疼痛水平：0，无疼痛；1，轻微可以忍受的疼痛；2，中等程度疼痛，需要非吗啡类止痛药物干预；3，严重的疼痛，需要吗啡类药物干预.
1.2方法用Trizol法按操作说明从每例标本50 mg胰腺癌组织中抽提总RNA. 采用无RNA 酶的DNA酶Ⅰ处理,以提高RNA纯度,并使用Qiagen RNeasy Kit进一步纯化总RNA,操作方法按说明进行. 分光光度计测定总RNA的纯度,琼脂糖凝胶电泳初步评价总RNA质量, 确保总RNA的A260/A280之值在1.8～2.0 之间. 琼脂糖凝胶电泳, 18 s和28 s电泳条带清晰, 28 s和18 s亮度之比≥2. 实时定量PCR应用Primer premier 5.0软件,参照各靶基因序列设计引物（表1）,TBP(TATA?box?binding protein)备用作管家基因. 每份标本取总RNA 5 μg,在逆转录酶SuperscriptⅡ( Invitrogen公司)作用下合成cDNA,加入引物1 μL，荧光染料SybrGreenI 0.5 μL,总反应体积25 μL,按Invitrogen RT?PCR kit操作说明应用ABI?7700进行PCR扩增,反应条件: 50℃孵育2 min, 95℃ 10min, 45个循环, 95℃ 15s, 60℃ 1 min.
统计学处理: 采用SPSS13.0 软件包, 对年龄、性别、淋巴结转移、疼痛程度、肿瘤大小、神经浸润程度等可能影响中晚期胰腺癌预后的因素进行单因素和多因素分析. 两变量相关分析采用Spearman秩相关；两组间生存率曲线比较采用log?rank 法, 多因素分析采用Cox 比例风险回归模型, 率的比较采用χ2检验, 检验水平定为α=0.05.
表1扩增靶基因的引物序列（略）
2结果
2.1TrkA及p75在胰腺癌中的分布TrkA mRNA的浓度为0.53±0.92（0.003～4.660），下四分位数为0.137而上四分位数为0.437；p75 mRNA的浓度为0.95±1.58（0.001～6.660），下四分位数为0.142而上四分位数为0.548.
2.2TrkA及p75表达与临床病理的关系TrkA及p75基因表达水平均与疼痛及神经浸润有关（χ2检验）；TrkA与p75表达水平负相关（P<0.05），TrkA，p75与疼痛，神经浸润程度有关（P<0.05,表2）.
表2TrkA和p75的表达与临床病指标的关系（略）
2.3预后Cox单变量分析揭示高p75表达患者较高TrkA患者可延长总生存时间 （设定所有病例的p75及TrkA表达量的上四分位数为高表达界值），TrkA（P=0.013），神经浸润（P=0.011），及疼痛（P=0.018）是预后不良的影响因素（图 1），组织学分级，肿瘤大小，淋巴结转移不是预后因素. 在无病生存中p75（P=0.000）及疼痛（P=0.012）为预后因素；Cox多变量分析揭示，p75，TrkA，神经浸润和疼痛为影响总生存率的独立因素.
A: TrkA高表达患者预后不良（P<0.01）; B: p75高表达患者预后好（P<0.01）.
图1校准后TrkA和p75进行总生存率的 Kaplan?Meier分析（略）
3讨论
NGF是一种多功能性、多肽性物质,它通过特异的靶细胞表面的神经生长因子受体(nerve growth factor receptor, NGFR)TrkA及p75介导产生生物学效应. Zhu等［3-4］分析结果表明胰腺癌NGF mRNA，TrkA mRNA 水平比正常胰腺组织增加2.7 和5.6 倍,NGF在癌细胞胞质中强表达, NGF mRNA 和TrkA mRNA 表达水平在有神经浸润的肿瘤中,比无神经浸润的高,且在高表达NGF 和TrkA 的肿瘤中,周围神经浸润更易发生,提示癌细胞释放的NGF 并非通过旁分泌或自分泌作用于自身,而是与神经束膜上出现的TrkA 相互作用,使神经与癌细胞相接触,导致TrkA 介导的周围神经浸润，这和我们的结果一致. 国内孙沫逸等［5］在涎腺腺样囊性癌中也有类似结果报道. 说明NGF/ TrkA 通路在胰腺癌沿神经播散和侵犯神经及临床疼痛、预后中,起着重要的作用. 我们的研究提示,患者的预后决定于NGF 两个受体p75 与TrkA 的比例也通过实验表明NGF 对胰腺癌细胞生长的影响取决于两种受体表达水平及两者之间的平衡,p75 对凋亡究竟起正调节还是负调节作用,p75 与TrkA究竟是协调还是相拮抗,决定于两种受体的不同表达水平,p75 介导的细胞凋亡作用大多发生在 TrkA 受体表达缺如或功能受阻断的细胞中［2］. 另有研究发现，在裸鼠胰腺癌模型中应用TrkA酪氨酸家族抑制剂（CEP?701）可明显抑制NGF介导的异种移植胰腺导管细胞癌的生存，相对减少肿瘤生长体积的50%～70%［6］. 我们的研究提示胰腺癌患者中高p75水平与患者的良好预后密切相关，而TrkA为肿瘤恶性进展的标记，患者的预后与NGF两个受体p75 与TrkA 的表达比例有关，可以作为探索胰腺癌方法的新的靶目标.
【】
［1］ Hirai I, Kimura W, Ozawa K, et al. Perineural invasion in pancreatic cancer［J］. Pancreas, 2002, 24(1):15-25.
［2］ 党诚学，王健生，秦兆寅，等. 胰腺癌神经侵润途径的探讨和临床意义的研究［J］.中华肝胆外科杂志，2001,7(6):357-358.
［3］ Zhu ZW, Friess H, Wang L, et al. Nerve growth factor exerts differential effects on the growth of human pancreatic cancer cells［J］. Clin Cancer Res, 2001, 7(1): 105-112.
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