糖尿病大鼠视网膜缺氧诱导因子

【关键词】  STZ大鼠；,糖尿病视网膜病变；,缺氧诱导因子；,血管内皮细胞生长因子

　　Expressions of hypoxiainducible factor1α and vascular endothelial growth factor in retina of streptozotocininduced  diabetic rats

　　【Abstract】 AIM: To study the expressions of hypoxiainducible factor1α (HIF1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in retina of streptozotocininduced diabetic rats. METHODS: Sixty Wister rats were divided into testing group (group T, 45 cases) and control group (group C, 15 cases). Streptozotocininduced diabetic animal models were made in group T, and then the rats were divided into 3 groups ( T1, T3, T5) according to the time (1, 3, 5 months) after modeling. The rats in group C were also divided into 3 groups (C1, C3, C5). The expression of VEGF was assessed by immunohistochemical method and the expression of HIF1α was assessed by Western Blotting. All the results were quantitatively analyzed by transformed into average optical density. RESULTS: 86.67%-93.33% of all the animal models were successful. Results of VEGF: There were no significant difference in the 3 control groups, as well as between group T1 and control groups (P>0.05); But the significant difference was found between group T3, T5 (t=6.12, P<0.01) and control groups (t=8.63, P<0.01) as well as between group T3 and T5 (t=3.45, P<0.05). Results of HIF1α: There was no significant difference in the 3 control groups and in the 3 testing groups (P>0.05). But the significant differences were found between group T1, T3,  T5 and the 3 control groups (t=4.35, 5.01, 5.34, P<0.01). CONCLUSION: We observed the increased expression of VEGF and HIF1α in retina of streptozotocininduced diabetic rats, and the latter occurred earlier than the former. It suggests that the increased expression of HIF1α might be the initial factor for expression of VEGF during diabetic retinopathy.

　　【Keywords】 streptozotocininduced diabetic rats; diabetic retinopathy; hypoxiainducible factor; vascular endothelial growth factor

　　【摘要】 目的：探讨链脲佐菌素（STZ）糖尿病大鼠视网膜组织中缺氧诱导因子1α（HIF1α）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达. 方法：Wister大鼠60只，分为实验组(T组,45只）和对照组(C组,15只）. 实验组建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型，并随机分为T1，T3，T5三个组，每组15只，分别代表糖尿病模型1， 3， 5 mo;对照组同样随机分为C1，C3，C5三个组，每组5只. 分别采用免疫组织化学法检测视网膜VEGF表达、免疫印迹法检测视网膜HIF1α表达，结果以平均吸光度值进行定量比较. 结果：糖尿病模型成功率86.67％~93.33%. VEGF检测结果：对照组各组间差别无统计学意义（P＞0.05）；T1与对照组间差别无统计学意义（P＞0.05），但T3，T5与对照组间差别均有统计学意义（t值分别为6.12，8.67，P<0.01），并且T3，T5两组间差别也有统计学意义（t=3.45，P<0.05）. HIF1α检测结果：对照组各组间差别无统计学意义（P＞0.05）；T1，T3，T5分别与对照组相比，其差异均有统计学意义（t值分别为4.35，5.01，5.34，P<0.01），但实验组各组间差异无统计学意义（P＞0.05）. 结论：STZ糖尿病大鼠视网膜内可观察到VEGF和HIF1α的高表达，后者早于前者，提示在视网膜病变时HIF1α的表达可能是VEGF表达的始动因素.

　　【关键词】 STZ大鼠；糖尿病视网膜病变；缺氧诱导因子；血管内皮细胞生长因子

　　0　引言

　　糖尿病目前已成为严重危害公共健康的问题，可引起全身多数器官并发症，而其中微血管并发症之一的视网膜病变（diabetic retinopathy，DR），也日益成为致盲的主要原因. 有关DR的病理生理过程已有大量实验研究，并已发现血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是引起DR血管渗漏、新生血管形成的主要细胞因素之一［1］. 然而， 在糖尿病患者眼部微环境下引起VEGF等细胞因子大量分泌的确切机制还不甚明了. 本实验我们从缺氧诱导因子1α（hypoxiainducible factor1α， HIF1α）这一途径， 探讨糖尿病条件下视网膜VEGF表达增加的机制.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　选取封闭群雄性Wistar大鼠60只，体质量190～210 g，适应性饲养3 d，分为实验组（T组，45只）和对照组（C组，15只）. 将T组再随机分为T1，T3，T5三个组，每组15只，分别代表糖尿病模型1，3，5 mo；C组同样随机分为C1，C3，C5三个组，每组5只. 所有动物均在相同条件下饲养. 链脲佐菌素（streptoztocin, STZ)，美国Sigma公司产品；一抗为兔抗鼠VEGF mAb（1∶100），二抗为生物素化羊抗兔IgG，所有抗体和SABC试剂盒，DAB显色剂均购于美国DAKO公司;一抗（1∶200兔抗HIF1α多克隆抗体)，美国Sigma公司.

　　1.2方法

　　1.2.1糖尿病大鼠模型的建立［2］

　　取STZ溶于0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，配置成浓度1.25%的溶液，按60 mg/kg对T组大鼠行一次性腹腔内注射，C组大鼠腹腔注射等量柠檬酸缓冲液. 药物注射后24～48 h检测血糖和尿糖，血糖浓度高于16.5 mmol/L，尿糖达～，尿量、饮水明显增多即为模型建立成功；低于上述标准则为造模失败.  实验组T1，T3，T5及对照组C1，C3，C5分别在造模成功后1，3，5 mo处死，取标本进行下列实验.

　　1.2.2免疫组织化学法（SABC）检测

　　视网膜VEGF的表达实验动物经10 g/L戊巴比妥钠（40 mL/kg）腹腔麻醉，用0.1 mo/L含有40 g/L多聚甲醛的PBS液灌流固定，摘除眼球，石蜡包埋后行16 μm连续切片，SABC法行免疫组织化学染色检查，其中对照组一抗以PBS液代替，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行. 阳性结果为胞浆内出现棕褐色颗粒. 染色结果用LuzexF实时图像分析系统进行分析，平均A值.

　　1.2.3免疫印迹法（Western Blot）检测

　　视网膜HIF1α的表达实验动物同前麻醉，固定后，摘除眼球去除眼前段成眼杯，仔细分离出视网膜组织，剪碎后置于裂解液中机械匀浆，4℃，17 000 g离心30 min，取上清液以紫外分光光度计定量，等量蛋白上样进行75 g/L SDSPAGE电泳，电泳后湿转至硝酸纤维素膜上. 37℃孵育2 h，洗膜，加1∶1000的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加入化学发光液反应1 min，曝光显影后冲洗胶片. 显色结果同样用图像分析系统计算平均A值.

　　统计学处理： 用SPSS 11.0统计软件对各实验数据进行分析处理，结果以x±s表示，采用Fisher确切概率计算法、多组间比较方差分析、组间比较t检验等进行差异显著性分析.

　　2　结果

　　2.1大鼠糖尿病模型

　　实验组腹腔注射STZ后成功复制出糖尿病动物模型：T1组15例，成功14例，失败1例；T3组15例，成功13例，失败2例；T5组15例，成功14例，失败1例. 通过Fisher确切概率计算法（PT1:3，PT3:5，PT1:5的概率分别为0.388，0.388，0.517），可见三组之间的造模成功率无显著差异，故可以认为三组的造模成功率基本一致.

　　2.2各组不同时段视网膜VEGF表达

　　免疫组化染色结果显示，对照组各组视网膜VEGF可见弱表达，一般在内核层可见少数阳性染色，但不随时间变化而改变（图1）. 各组不同时段之间的VEGF A值并无显著性差异（表1）. 实验组在成模后1 mo， VEGF表达较对照组仅略有增强，其A值与对照组相比并无显著性差异，但随着时间的延长，实验组VEGF表达明显增强，特别是T5组，视网膜内核层、节细胞层及血管壁等均可见阳性染色（图2）.表1各组不同时段VEGF及HIF1α A值（略）

　　2.3各组不同时段视网膜HIF1α表达通过免疫印迹检测，对照组各组HIF1α有弱表达，其A值维持一基线状态，不同时段差别无统计学意义（表1）. 实验组各组HIF1α表达均明显增强，与对照组相比有显著性差异，但各组A值并不随时间改变而发生显著变化，组间差别无统计学意义（表1）. 图3显示成模5 mo后实验组与对照组HIF1α免疫印迹结果（M为标记物，上下两个条带分别代表225 bp和162 bp）.

　　3　讨论

　　STZ大鼠是目前比较公认的经典糖尿病DR模型，基本可以模拟人背景型DR的大致病理改变［2］. 本实验成功复制出STZ大鼠模型，成功率在90%左右，保证了后续实验结果的真实可信.
　　
　　糖尿病DR是糖尿病微血管病变在眼底独特环境中的表现，其中VEGF起着举足轻重的作用. VEGF导致新生血管的原因，一方面是直接促进微血管内皮细胞增生，另一方面是VEGF使微血管内皮细胞通透性增强，大分子物质如纤维蛋白原等进入细胞外基质中形成纤维蛋白凝胶，允许并支持新生血管和基底细胞向内生长［3］. 临床研究也发现，在合并活动性新生血管病变的眼如糖尿病性DR、视网膜中央静脉阻塞、早产儿DR等的眼内液中VEGF表达显著增高，而在无新生血管对照眼的眼内液中则表达较低. 眼内直接给予VEGF更能诱发出典型的新生血管病变［4］. 本实验在成模后3 mo和5 mo大鼠视网膜上观察到了明显的VEGF高表达，并且有随时间延长表达逐渐增多的趋势，与对照组相比有显著性差异，而1 mo组则没有明显增多，提示VEGF是在缺氧发生后，某些始动因素的刺激下表达增多，符合糖尿病DR的.
　　
　　为明确DR时引起VEGF表达增多的原因，本实验还观察了缺氧诱导因子1α（HIF1α）的变化. HIF1是细胞在缺氧条件下产生的核蛋白，它作为转录因子与靶基因结合，促进其转录，从而使机体产生一系列缺氧适应反应. HIF1是一种异源二聚体，由HIF1α和HIF1β两个蛋白质亚基组成， HIF1β亚基主要起结构性的作用，在细胞内稳定表达；HIF1α则是主要的功能亚基，受缺氧信号的调控，并且只有在缺氧状态下才能稳定表达. HIF1的活性主要由HIF1α的蛋白质水平和活性决定［5］. 能被HIF1诱导的基因启动子或增强子内有一个小于100 bp的DNA序列，称为缺氧反应元件（hypoxia response element, HRE），介导细胞对缺氧的反应，HRE由HIF1结合位点和两侧的功能序列构成. 缺氧条件下HIF1α和HIF1β蛋白由胞浆进入核内，发生二聚形成稳定的HIF1，活化的HIF1与靶基因HRE中的HIF1结合位点结合，形成转录起始复合物，促进其转录，引起一系列细胞对缺氧的反应［6］. 而VEGF正属于上述靶基因之列，其转录起始点上游具有HRE结构，缺氧状态下可被HIF1激活而表达增多［7］. 本研究发现，造模成功后1 mo，即可见到HIF1α的表达增多，与对照组有显著性差异，提示此时视网膜已经发生缺氧性改变. 但是其后一段时间内，虽然HIF1α都保持高表达，但是不同时段之间却并无显著性差异，即HIF1α似乎并无随时间延长不断增多的趋势，这可能与HIF1的半衰期短有关. Huang等［8］发现：由于HIF1经泛素蛋白酶途径不断发生水解，使其在常氧下的半衰期小于1 min，因此它很难在细胞内大量聚集，只能在受到缺氧信号刺激后不断产生，如果缺氧状态持续存在，则它的表达就持续增高，不过不能像VEGF那样表现出随时间不断增高的趋势.

　　由于实验中对VEGF的检测采用的是免疫组化的方法，受敏感性的限制，在成模后1 mo时，尚不能发现VEGF蛋白质表达的变化，按照实验中HIF1α的变化规律，推测此时VEGF表达也应有一定程度的增多，这有待今后加以探索.

　　【】

　　［1］Shen WY, Lai CM, Graham CE,et al. Longterm global retinal microvascular changes in a transgenic vascular endothelial growth factor mouse model［J］. Diabetologia, 2006, 49(7): 1690-1701.

　　［2］宋鄂, 董宇, 石博, 等. STZ糖尿病大鼠视网膜病变模型的评价［J］.眼科研究, 2004, 24(2):124-127.

　　［3］Ferrara N, DavisSmyth T. The biology of vascular endothelial growth factor［J］. Endocr Rev, 1997,18(1):4-25.

　　［4］Suganthalakshmi B, Anand R, Kim R, et al. Association of VEGF and eNOS gene polymorphisms in type 2 diabetic retinopathy［J］. Mol Vis, 2006,11(12):336-341.

　　［5］Arjamaa O, Nikinmaa M. Oxygendependent diseases in the retina: Role of hypoxiainducible factors［J］. Exp Eye Res, 2006,83(3):473-483.

　　［6］Chen C, Pore N. Regulation of glut 1 mRNA by hypoxiainducible factor: Interaction between Hras and hypoxia［J］. J Biol Chem, 2001,276(12):9519-9525.

　　［7］Michel G, Minet E, Mottet D, et al. Sitedirected mutagenesis studies of the hypoxiainducible factor1 alpha DNAbinding domain［J］. Biochim Biophys Acta, 2002,1578(13):73-83.

　　［8］Huang LE, Arany Z, Livingston DM,et al. Activation of hypoxiainducible transcription factor depends primarily upon redoxsensitive stabilization of its alpha subunit［J］. J Biol Chem, 1996, 271(50):32253-32259