人白介素24基因诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的实验研究

【关键词】  人白细胞介素24；Ca,Ski细胞；乳头状瘤病毒,人；,E6基因；蛋白质P53；细胞凋亡

　　Apoptosis induction of human cervical cancer Ca Ski cells by hIL24 gene

　　【Abstract】 AIM: To investigate the hIL24 gene inducing  apoptosis of human cervical cancer Ca Ski cells and its possible mechanism. METHODS: Ca Ski cells were transfected with hIL24  eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)hIL24  by lipofectamine2000. The effect of hIL24 on the transcription of HPV E6 gene was analyzed by RTPCR. The effect of hIL24 on P53 protein was analyzed by Western Blot. Apoptosis of Ca Ski cells induced by hIL24 gene was analyzed by FACS. RESULTS: Transcription level of HPV E6 gene decreased significantly, the amount of P53 protein increased significantly and the apoptosis rate of Ca Ski cells increased significantly after hIL24 transfection. CONCLUSION:  HIL24 gene can inhibit the transcription of HPV E6 gene, recover the activity of P53 protein, then induce the apoptosis of Ca Ski cells.

　　【Keywords】 human interleukin24; Ca Ski cells; papillomavirus, human;  E6 genes; protein P53 ; apoptosis

　　【摘要】 目的：  研究人白介素24(hIL24)在体外诱导宫颈癌Ca Ski细胞凋亡及其作用机制. 方法：  ① 以脂质体包裹重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)hIL24转染Ca Ski细胞； ② 利用RTPCR技术检测处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化； ③  Western Blot分析处理后Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平的变化； ④ 流式细胞仪分析处理后的Ca Ski细胞凋亡情况.  结果： 处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平下降，抑癌蛋白P53水平增加，细胞凋亡率升高. 结论： 真核表达载体介导的hIL24基因体外转染宫颈癌Ca Ski细胞后，能抑制Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的表达，使抑癌蛋白P53恢复活性，促使宫颈癌Ca Ski细胞凋亡.

　　【关键词】 人白细胞介素24；Ca Ski细胞；乳头状瘤病毒，人； E6基因；蛋白质P53；细胞凋亡

　　0引言

　　人白介素24（hIL24）是IL10细胞因子家族中的新成员［1］. hIL24对肿瘤细胞有特异性的抑制和杀伤作用，如诱导凋亡、抑制生长和抑制肿瘤血管生长，而对正常细胞没有影响,其显著的抗肿瘤特性使之成为肿瘤的新热点［2-3］. 子宫颈癌是危害广大妇女健康最常见的恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌而位居第二. 近年来，年轻妇女中宫颈癌的发病率呈明显上升的趋势［4］，宫颈癌越来越引起人们广泛的关注. 本实验我们采用hIL24基因的真核表达载体转染宫颈癌Ca Ski细胞，以探讨hIL24对宫颈癌的治疗效果.

　　1材料和方法

　　1.1材料重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)hIL24，空质粒pcDNA3.1(+)，表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pEGFPC1与人宫颈癌Ca Ski细胞株均为本室保存. Trizol、逆转录试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京鼎国公司；所有的抗体购自Santa cruz公司；脂质体lipofectamine2000购自invitrogen公司；寡核苷酸引物合成由上海生工完成，质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司，AnnexinV/FITC染色试剂盒购自晶美公司.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养人宫颈癌Ca Ski细胞于含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养.

　　1.2.2质粒抽提与定量使用QIAGEN公司的质粒抽提试剂盒分别抽提重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)hIL24,空质粒pcDNA3.1(+)与表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFPC1. 使用紫外分光光度计测定质粒的浓度.

　　1.2.3转染与转染效率观测将Ca Ski细胞传代为3瓶（即分为3组： ① 未处理组；② 对照组；③ 实验组），使之次日融合率大约为80%. 第1瓶不作处理；第2瓶对照组细胞按照Lipofectamine2000试剂盒操作规程［质粒/脂质体为1∶2（M/L）］转染入pcDNA3.1(+)空质粒；第3瓶实验组细胞转染入pcDNA3.1(+)hIL24重组质粒. 以相同条件转染pEGFPC1，48 h后用荧光倒置显微镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞比率以帮助判定转染效率.

　　1.2.4细胞总RNA的提取用Trizol试剂分别抽提处理48 h后的3组Ca Ski细胞的总RNA.

　　1.2.5E6癌基因引物设计与合成上游引物： 5′ACTTTGCTTTTCGGGATTTATGC3′; 下游引物：5′AGGACACAGTGGCTTTTGACAGTT3′;PCR产物长度：205 bp.

　　1.2.6Ca Ski细胞中人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV） E6癌基因的mRNA水平变化按照常规两步法进行RTPCR. 第一步RT： 提取的总RNA 取2 μL作为RT反应模板，反应体系为20 μL：随机引物(25 μmol/L)1 μL，dNTP(各10 mmol/L )2 μL，逆转录酶16.67 nkat；反应参数为：30℃ 10 min, 42℃ 20 min, 99℃ 5 min, 4℃ 5 min：第二步PCR：取RT反应产物5 μL作为PCR反应模板，反应体系为50 μL：E6基因上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，GAPDH基因（内参）上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTP(各10 mmol/L)1 μL，Taq酶16.67 nkat；反应参数为：95℃ 5 min,1个循环；94℃ 30 s，54℃ 40 s，72℃ 40 s，30个循环；72℃ 10 min，1个循环. PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用Imagetool图像分析软件E6基因条带与内参条带A比值，以其表示E6 mRNA含量的相对强度. 重复3次.

　　1.2.7Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平的变化由于E6蛋白的含量极低且降解迅速，所以采用P53蛋白水平的变化来间接反映E6蛋白水平的变化(P53是E6直接作用的下游靶分子). 分别收集处理48 h后的3组Ca Ski细胞的细胞裂解液，进行Western Blot，以actin为内参. 使用Imagetool图像分析软件计算P53蛋白条带与内参条带A比值，以其表示P53蛋白表达的相对强度. 重复3次.

　　1.2.8Ca Ski细胞凋亡情况采用AnnexinV/FITC与PI双标进行流式细胞仪分析. 重复3次.
 
　　统计学处理： 先对样本进行方差齐性检验，方差齐时组间比较采用方差分析及LSDt检验，方差不齐时组间比较采用KruskalWallis H检验及Nemenyi检验，P<0.05时认为差异有统计学意义.

　　2结果
 
　　2.1转染效率判定转染质粒48 h后，荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞比率大约为50%. 初步判定转染效率为50%左右（图1）.

 
　　图1转染质粒48 h后Ca Ski细胞表达绿色荧光蛋白的情况(略) 

　　2.2RTPCR检测处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化未处理组和对照组Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平无统计学差异（P>0.05），而实验组Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平与前两组比较均下降(P<0.05，表1，图2）.

　　表1三组Ca Ski细胞的E6  mRNA水平、P53蛋白水平和细胞凋亡率(略)

　　图2E6基因RTPCR产物的琼脂糖电泳图　略

　　2.3Western Blot分析处理后Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平的变化未处理组与对照组Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平无统计学差异（P>0.05），而实验组Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平与前两组比较均增加(P<0.05，表1，图3）.

　　图3蛋白印迹检测Ca Ski细胞中P53蛋白水平　略
 
　　2.4流式细胞仪分析处理后的Ca Ski细胞凋亡情况未处理组与对照组Ca Ski细胞无明显凋亡发生，两组间无统计学差异（P>0.05）. 而实验组Ca Ski细胞的凋亡率与前两组比较均升高(P<0.05，表1，图4）.

　　图4流式细胞仪分析处理后的Ca Ski细胞凋亡情况　略

　　3讨论

　　IL24是由Jiang等于1995年用IFNβ和MEZ诱导黑素瘤细胞终末分化时,利用消减杂交克隆得到,其后鉴定为IL10家族的新成员. 一系列研究证实IL24具有广谱抗肿瘤活性，对多种组织起源的肿瘤细胞如黑素瘤［5］、前列腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、卵巢癌、结肠癌、皮肤癌、胰腺癌、肺癌、骨肉瘤细胞均有显著的生长抑制效应和诱导凋亡作用，但对正常细胞无明显毒副作用. 而且，它还能在肿瘤组织内促进血管内皮细胞分化从而抑制血管形成. IL24是一个分泌型细胞因子，可对周围癌细胞行“旁观者杀灭效应”［6-7］，具有刺激免疫系统的功能，还能使某些癌细胞对射线更加敏感［8］. 目前的研究显示，IL24基因很可能是第一个既抑制肿瘤生长又表达刺激免疫系统的蛋白基因，是目前发现的唯一一个细胞因子类的抑癌基因. 目前有adp53,adbax等应用于肿瘤的基因研究中，但大多数的应用由于临床治疗潜力差和对正常组织的毒性高且不具有通过刺激免疫应答来杀伤肿瘤细胞的特性而受限. 而IL24就以它上述的优点成为目前最理想的肿瘤基因治疗的候选基因.
    
　　我国每年子宫颈癌新发病例有13.5万. 近年来发现，年轻妇女中宫颈癌的发病率呈明显上升的趋势，发病以每年2%~3%的速度增长. 宫颈癌越来越引起人们广泛的关注.
　　
　　HPV被认为是一个强力的人类致肿瘤因子. 国内外一系列研究证明，高危型HPV感染是子宫颈癌的主要危害因素［9］，其中以HPV16, 18型与子宫颈癌发病的关系最为密切，其相关性高达85%以上. 目前的研究认为，宫颈癌的发生主要与HPV的E6和E7基因有关. 其致癌的关键是：E6癌基因编码合成的E6蛋白可以与细胞内野生型抑癌基因产物P53蛋白相结合，在E6相关蛋白的作用下使P53经泛素介导的途径降解，从而使P53抑制细胞生长及促进凋亡的作用丧失，使细胞中DNA损伤累积，从而诱导宫颈组织癌变.
    
　　在多种组织起源的肿瘤细胞中，IL24的抗肿瘤效应与p53, RB, p16, ras,bax和caspase3的突变状态无关，所以对P53失活的子宫颈癌细胞系特别适用. 所以我们选择含有高拷贝（约600 copy）HPV16病毒的宫颈癌Ca Ski细胞作为研究IL24抑癌效应的对象.
　　
　　本实验我们采用hIL24基因的真核表达载体转染人宫颈癌Ca Ski细胞，发现实验组Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平明显下降，抑癌蛋白P53水平显著增加，促进宫颈癌Ca Ski细胞凋亡. 以上结果表明以真核表达载体介导的hIL24基因在体外能显著促进人宫颈癌Ca Ski细胞的凋亡，为将来hIL24应用于临床提供了实验基础.

　　【】

　　［1］ Fickenscher H,  Hor S,  Kupers H, et a1.  The interleukin10 family of cytokines［J］．Trends Immunol，2002, 23(2)：89-96.

　　［2］ Gupta P, Su ZZ, Lebedeva IV, et al.  mda7/IL24: Multifunctional cancerspecific apoptosisinducing cytokine［J］. Pharmacol Ther, 2006,111(3)：596-628.

　　［3］ Sarkar D，Su ZZ，Lebedeva IV, et a1．Mda7(IL24) Mediates selective apoptosis in human melanoma cells by inducing the coordinated overexpression of the GADD family of genes by means of p38 MAPK［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2002,99(15)：10054-10059.

　　［4］ 韩英，丁岩.  子宫颈癌病因及发病机制研究进展［J］. 新疆医学，2004,34(2):114-117.

　　［5］ Lebedeva IV，Su ZZ，Chang Y ,et al．The cancer growth suppressing gene mda7 induces apoptosis selectively in human melanoma cells［J］．Oncogene , 2002,21(5):708-718．

　　［6］ Su Z, Emdad L, Sauane M, et al. Unique aspects of mda7/IL24 antitumor bystander activity: Establishing a role for secretion of MDA7/IL24 protein by normal cells［J］. Oncogene, 2005,24(51):7552-7566.

　　［7］ Sauane M, Lebedeva IV, Su ZZ, et al. Melanoma differentiation associated gene7/interleukin24 promotes tumor cellspecific apoptosis through both secretory and nonsecretory pathways［J］. Cancer Res, 2004,64(9): 2988-2993.

　　［8］ 韩文玲，马大龙.  新细胞因子IL24研究进展［J］. 中华免疫学杂志 , 2003,19(3):211-212.

　　［9］ Dipaolo JA , AlvarezSalas LM. Advances in the development of therapeutic nucleic acids against cervical cancer［J］ . Expert Opin Biol Ther , 2004, 4(8):1251-1264.