还原性谷胱甘肽对急性坏死性胰腺炎肺损伤的影响

【关键词】  胰腺炎,急性坏死性；肺损伤；细胞因子；谷胱甘肽；

　　Effect of reduced glutathione on lung injury in rats with acute necrotizing pancreatitis

　　【Abstract】 AIM: To investigate the changes of transcription factor nuclear factorκB (NFκB), TNFα, IL1β, IL18, myeloperoxidase (MPO) in the lung of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and explore the effects of reduced glutathione (GSH) on lung injury. METHODS: Wistar rats (n=72) were divided into 3 groups at random, ANP group, GSH treated group, and sham operation (SO) group. Animals in the 3 groups were killed 6, 12 and 18 h after operations and lung tissue, pancreas tissue were harvested. The expressions of  IL18, IL1β, TNFα in  lung tissue were measured by immunohistochemistry. MPO was determined by chromatometry. Intrapulmonary expression of NFkBp65 mRNA was detected by RTPCR. The histopathology of lung and pancreas was observed under the light microscope. RESULTS:  The expressions of NFκB  mRNA,  IL18, IL1β, TNFα and the activity of MPO in lung tissue were much higher at 6, 12, 18 h in ANP group, with statistical significance compared with the SO group (P<0.05) and the levels of NFκB mRNA, IL1β and TNFα reached the peak at 12 h. After treatment with GSH, the levels of IL18, IL1β, TNFα became lower at 6, 12, 18 h and NFκB mRNA, MPO were decreased at 12 h (P<0.05 vs ANP group). CONCLUSION: All of NFκB， TNFα, IL1β, IL18 and MPO have something to do with acute lung injury in experimental acute necrosis pancreatitis. GSH may inhibit the activity of NFκB and neutrophil in lung tissue, decrease the concentrations of inflammatory  cytokines (TNFα, IL1β, IL18), thus exerting the preventive effect against  lung injury.

　　【Keywords】 pancreatitis, acute necrotizing; lung injury; cytokine; glutathione; therapy

　　【摘要】 目的：观察急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺组织核因子κB(NFκB)mRNA，细胞因子（TNFα，IL1β，IL18），髓过氧化物酶（MPO）的变化，探讨还原性谷胱甘肽（GSH）治疗肺损伤的机制. 方法：72只Wistar大鼠随机分成3组： ANP组, GSH组，SO组（假手术组）. 于术后6,12,18 h取肺组织供实验用. 免疫组化测定肺中IL1β,IL18,TNFα的表达，比色法测定MPO的活性，RTPCR检测NFκB p65 mRNA的表达，胰、肺行组织学观察. 结果：ANP组肺组织NFκB mRNA，IL18, IL1β,TNFα,MPO的水平升高，NFκB，IL1β,TNFα在12 h达高峰，与SO组相比各时间点均有统计学差异(P<0.05). GSH治疗后IL1β,IL18,TNFα在各时间点均降低，NFκB mRNA，MPO在12 h降低(P<0.05). 结论：ANP时NFκB，IL18,IL1β,TNFα及MPO均参与了肺损伤，GSH能够抑制肺NFκB活化，促炎因子的表达及中性粒细胞的聚集，对肺损伤有保护作用.

　　【关键词】 胰腺炎,急性坏死性；肺损伤；细胞因子；谷胱甘肽；治疗

　　0引言

　　急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)时，粒细胞被激活，促炎因子大量释放，导致胰外器官损伤，以肺损伤最早出现且最常见. 核因子κB(NFκB)是具有多项转录调节作用的因子，介导肿瘤坏死因子α，白介素1β的表达. 白介素18是重要的炎症因子，能激活粒细胞，并与TNFα,ILβ相互诱导激活，形成炎症因子. 还原性谷胱甘肽抗炎、抗氧化，对多种脏器的损伤具有保护作用［1］. 本实验我们通过观察ANP大鼠肺组织NFκB mRNA，TNFα,IL1β,IL18，MPO的水平，探讨GSH的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料Wistar大鼠72只， 雌雄不限， 体质量250~300 g，由兰州大学动物实验中心提供. 注射用还原性谷胱甘肽为重庆药友制药有限责任公司生产. 牛磺胆酸钠购自Sigma公司. 一抗及免疫组化染色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司. AMV一步法RTPCR试剂盒、引物均来自上海生工生物工程公司. NFκB(目的片段长度221 bp)上游：ACGATCTGTTTCCCCTCATC；下游：TGCTTCTCTC CCCAGGAATA；βactin（目的片段长526 bp）上游：CTGTGCCCATCTATGAGGGT；下游：CAGTGAGGCCAGGATAGAGC.

　　1.2方法

　　1.2.1动物模型的制备［2］与标本收集采用50 g/L牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射制备ANP动物模型.  50 g/L的戊巴比妥钠4 mL/kg腹腔注射麻醉，正中切口入腹，胆管入肝处用小动脉夹夹闭胆管，在十二指肠的降部，用针头穿刺胆胰管，3 min内缓慢、恒速注入50 g/L的牛磺胆酸钠1 mg/g，5 min后放开，关腹. GSH组于模型制成前1 h，肌注GSH(0.15 g/kg). 假手术组（SO）仅行胆胰管穿刺.  每个时段的大鼠取肺组织4份（0.3 g）分别用于组织学观察，免疫组化， MPO的检测，RTPCR.

　　1.2.2检测方法和指标①组织学观察： 肺、胰腺病变及胸腹水情况行大体观察；肺组织用40 g/L甲醛固定，常规包埋、切片，HE染色，光镜观察. ②比色法测定肺组织MPO活性： 制备50 g/L冰冻肺组织匀浆，离心后取上清，在460 nm光波下进行扫描记录A值，MPO的活性. ③免疫组化观察ANP大鼠肺组织IL18, IL1β, TNFα的表达： SABC法行免疫组织化学染色. 结果判定：随机取5个高倍视野(×200),使用BI2000图像分析系统进行定量扫描, 得到选定面积内的平均灰度值. 标本着色越深，灰度值越小. ④RTPCR检测NFκB p65的mRNA表达： 用Trizol提取肺总RNA，逆转录与扩增采用一步法进行，反应体系为50 μL，RTPCR Buffer 25 μL（含1.2 mmol/L MgSO4, 200 μmol/L dNTPs），RT/Taq Mix 1 μL(含MMuLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶)， 上、下游特异性引物各1 μL，模板RNA 3 μL（≤1 μg总RNA）,RNaseFree dH2O 19 μL. 反应条件为：45℃ 30 min, 94℃ 2 min, 94℃ 30 s, 51℃ 30 s, 72℃ 45 s,后三步反应进行35个循环，结束前72℃ 10 min，产物4℃保存. 20 g/L琼脂糖电泳,摄像，GeneTools软件分析条带、定量并计算目标片段与内参的比值.

　　统计学处理： 计量结果以x±s表示, 采用SPSS 10.0软件处理数据, 组间差异检验用单因素方差分析及LSDt两两比较. P<0.05认为具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1组织学观察大体观察见SO组胰腺、肺组织无明显异常. ANP组大鼠各时点均见胰腺水肿，有黄褐色坏死，肠系膜、大网膜有白色皂化斑，腹腔内大量腹水. 肺组织6 h见间质轻度水肿，12 h见血管扩张、充血，18 h可见多处散在出血点，水肿加重，胸腔少量积液. GSH组胰腺、肺组织水肿、坏死程度减轻，腹水、皂化斑减少，胸腔无渗液. 光镜观察：SO组未见明显变化. ANP组肺组织中见血管破裂出血，细胞水肿，间质增宽，炎细胞浸润. GSH组见肺组织充血水肿、少量炎细胞浸润，坏死程度减轻（图1）.

　　图1三组肺组织12 h时光镜下病理改变HE ×200　略

　　2.2GSH对肺组织MPO的影响6 h时三组间肺MPO活性无明显差异. 12,18 h时GSH组显著高于SO组并低于ANP组（P<0.01,P＜0.05, 表1).

　　表1各组大鼠肺组织髓过氧化物酶活性（略）

　　2.3GSH对肺组织IL18，IL1β，TNFα的影响阳性产物均为棕黄色颗粒，多分布于巨噬细胞、中性粒细胞及肺泡内皮细胞中. 阳性细胞多为细胞质着色. 三种因子ANP组的阳性细胞增多，IL1β，TNFα的表达在12 h时达高峰，各时点的灰度值明显低于GSH组、SO组(P<0.05, P<0.01, 图2），而GSH组又低于假手术组(P＜0.01，图2），差异均有统计学意义（表2）.

　　2.4GSH对肺组织NFκB p65 mRNA的影响三组中均可见到NFκB mRNA的表达. ANP组和GSH组的表达明显高于SO组(P＜0.01），12 h时GSH组低于ANP组（P＜0.05，表2，图3）.

　　3讨论

　　ANP发病机制尚未完全明确，其本质上是一种全身炎症反应综合征（system inflammatory response syndrome, SIRS）,患者易并发胰外脏器损伤，有20%A1~3分别显示ANP组肺组织IL18, IL1β, TNFα蛋白产物大量表达；B1~3分别显示GSH组肺组织三种因子的表达较ANP组明显减少；C1~3分别显示SO组肺组织三种因子表达又较GSH组减少.

　　图2三组12 h时IL18，IL1β，TNFα的表达免疫组化 ×400　略

　　表2三组大鼠各时点肺组织IL18，IL1β，TNFα蛋白、NFκB mRNA的表达(略）

　　图312 h时肺组织NFκB mRNA的RTPCR电泳图　略

　　有关其在ANP方面的研究日益增多，甚至认为是发病早期关键的免疫调节剂，可预示疾病的严重程度［4］. Leung等［5］发现，IL18参与中性粒细胞的激活，抑制抗炎细胞因子的表达，诱导生成促炎因子及黏附因子. IL1β，TNFα是ANP时重要的促炎因子，在肺损伤的早期发挥作用，可以与IL18相互诱导活化，并扩展和级联形成细胞因子，出现持续不受控制的炎症反应. NFκB是一种参与基因转录的核蛋白，广泛存在于各种细胞中，调节多种炎症因子的表达，而这些因子又能激活NFκB，使炎症反应进一步扩大，导致SIRS和多器官功能损伤. ANP时中性粒大量浸润、活化是肺损伤的主要原因. MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒释放的过氧化物类酶，在细胞中含量固定，测定它可以了解中性粒细胞的浸润、活化程度. 本研究显示大鼠肺、胰腺早期就有病理改变，出现NFκB 的活化，IL18，IL1β，TNFα表达水平的升高，MPO活性的增加，而且这些炎症因子的水平与肺损伤的程度密切相关. 说明中性粒细胞聚集，释放了大量炎症介质；NFκB激活使相关的炎症因子表达增加，炎症因子又激活NFκB，趋化中性粒细胞，引起扳机样级联效应，诱导和加重肺损伤，这与以往的研究相一致.
　　
　　GSH已经广泛地应用于临床，但具体作用机制以及与各种炎症介质的关系尚未完全明确. 疾病时GSH被大量的消耗了，外源性补充将有利于机体的恢复. 作为抗氧化剂，GSH在体内外均能抑制NFκB的活化［6］，减少与NFκB相关的炎症因子的表达，同时它可以降低肺MPO水平，减少中性粒细胞“呼吸爆发”产生的氧自由基，保护多脏器功能. 本实验我们探讨它与肺损伤之间的关系，发现GSH组肺组织MPO，NFκB活性降低，而且IL18，IL1β，TNFα的表达减少，说明药物抑制了NFκB的表达，降低了IL18，IL1β，TNFα的水平，减弱了细胞因子的作用；降低了MPO的活性，减轻了中性粒细胞的浸润、活化程度，早期应用可以减轻肺损伤. 传统不能完全抑制肺损伤的发生. 因此在基因转录及细胞因子水平上研究ANP并发症的发生、及药物的作用，将成为今后的热点.

　　【】

　　［1］ 黄中伟,唐建忠,陈瑜. 还原型谷胱甘肽对急性胰腺炎患者多脏器功能的保护作用［J］. 危重病急救医学, 2005,17(11)：673-674.

　　［2］  Makarov SS. NFκappaB as a therapeutic target in chronic inflammation: Recent Advances ［J］. Mol Med Today, 2000, 6(11):441-448.

　　［3］  Shields CJ, Winter DC, Redmond HP. Lung injury in acute pancreatitis: Mechanisms, prevention, and therapy ［J］. Curr Opin Cirt Care, 2002,8(2):158-163.

　　［4］  WereszczynkaSiemiatkowska U, Maroczko B, Siemiatkowski A et al. The importance of interleukin 18, glutathione peroxidase, and selenium concentration changes in acute pancreatitis ［J］. Dig Dis Sci, 2004,49(4):642-650.

　　［5］  Leung BP, Culshaw S, Gracie JA, et al. A  role for IL18 in neutrophil activation［J］. J Immunol, 2001,167(5):2879-2886.

　　［6］  Christman JW, Lancaster LH, Blackwell TS. Nuclear factor kappa B: A pivotal role in the systemic inflammatory response syndrome and new target for therapy ［J］. Intensive Care Med,1998,24(11):1131-1138.