骨髓间充质干细胞不同时期移植对心肌梗死大鼠心功能的影响

                       作者：侯志峰，龚卫琴，张珊红，王莹，王跃民，李源

【关键词】  骨髓间充质干细胞；心肌梗死；静脉移植；心功能

　　Effects of bone marrow stem cell transplantation at different time on heart function of rats with myocardial infarction

　　【Abstract】 AIM: To investigate the optimal time for bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation after myocardial infarction (MI). METHODS: MI was induced by occluding the left anterior descending artery (LAD) in SD rats. MSCs were isolated from the rats, purified, proliferated and they (1 mL) were transfused through caudal vein into transplantation groups (n=10/group) at 1 d, 1, 2, and 4 weeks after MI; the same culture medium (1 mL) was transfused into the control group (n=10). Four weeks later, the heart function and myocardial ischemic size and infarct size were evaluated. RESULTS: The heart function and myocardial ischemic size and infarct size of 1day group after MI had no difference from those of the control group (P＞0.05) . The improvement of heart function in 1, 2, and 4week groups were more distinct than that of 1day group (P<0.05); myocardial ischemic size and infarct size were also smaller than those of 1day group (P<0.05). Among the transplantation groups, the treatment effect of 2weeks group was the best. CONCLUSION: Subacute stage (1-2 weeks after MI) might be the optimal time for MSCs transplantation.

　　【Keywords】 born marrow mesenchymal stem cells；myocardial infarction；intravenous transplantation; heart function

　　【摘要】 目的： 探讨心肌梗死后骨髓间充质干细胞(MSCs)移植的最佳时间. 方法： 结扎大鼠左冠状动脉制备心肌梗死模型，将分离培养的大鼠MSCs经尾静脉分别移植到1 d, 1, 2, 4 wk移植组体内（各组n=10）,对照组则注入等量培养液（n=10）. 4 wk后测定左心功能指标和心肌缺血梗死面积. 结果: 心肌梗死后1 d移植组左心功能和心肌缺血梗死面积与对照组无明显差别（P＞0.05），而1, 2, 4 wk移植组与1 d移植组对比左心功能明显改善（P<0.05），心肌缺血梗死面积显著减小（P<0.05），其中2 wk移植组效果优于1 wk移植组和4 wk移植组（P<0.05）. 结论：心肌梗死后1～2 wk亚急性期进行细胞移植效果最好.

　　【关键词】 骨髓间充质干细胞；心肌梗死；静脉移植；心功能

　　0引言

　　传统观点认为心肌细胞属于不可再生细胞，一旦损害将无法修复，死亡的心肌细胞被成纤维细胞所代替，引起心脏结构的改变，心力衰竭的发生. 现有的内外科手段并不能很好地解决功能心肌细胞的丧失问题. 随着国内外干细胞试验研究的深入，干细胞移植治疗心肌梗死以及晚期心功能不全正日益成为一种新的治疗方法［1-2］. 骨髓间充质干细胞(MSCs)由于能够自我复制，具有分化的多功能性，并且无免疫排斥反应，因而在临床中具有广泛的应用前景［3-4］. 但是骨髓间充质干细胞移植在什么时候进行才能使机体获益最大？这个问题一直是细胞移植领域备受关注的课题. 本实验我们探讨在心肌梗死后不同时间静脉移植MSCs对心肌梗死大鼠心功能的影响，为MSCs移植的临床应用提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料低糖DMEM培养基（购于GIBCO公司）；胎牛血清（FCS，购于杭州四季青公司）；伊文氏蓝和红四氮唑（TTC，购于上海化学试剂采购站）. 清洁SD大鼠10只，雄性，100～150 g，作为MSCs供体. 另取清洁SD大鼠50只，雄性，200～250 g，随机等分为五组：心肌梗死后1 d移植组及1, 2, 4 wk移植组，对照组心肌梗死后1 d注射等量培养基. 所有动物均购于第四军医大学实验动物中心.

　　1.2方法

　　1.2.1大鼠MSCs的分离、培养和扩增雄性SD大鼠脱颈处死，用750 mL/L的乙醇浸泡15 min. 无菌条件下分离股骨和胫骨，用含体积分数150 mL/L FCS的LDMEM培养基反复冲洗骨髓腔，得到的细胞悬液接种到培养瓶，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养，72 h首次换液去除未贴壁细胞，以后每2 d换液1次. 待细胞覆盖到瓶底的80%时，用胰酶消化传代.

　　1.2.2大鼠心肌梗死模型的建立采用结扎左冠状动脉前降支的方法建立急性心肌梗死模型. 30 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（1.5 mL/kg）大鼠，颈、胸部术区消毒，气管插管，连接呼吸机，在心电监护下，左前第3～4肋间隙开胸，打开心包，暴露心脏，于左心耳下方3 mm处用7/0号无损伤丝线连同一小束心肌一起结扎左冠状动脉前降支，结扎后左室壁变苍白，心电监护可见R波振幅升高，ST段抬高，证明结扎成功. 术后逐层关胸，观察大鼠呼吸情况，平稳后拔除气管插管，术后给予抗生素预防感染，放入动物笼喂养.

　　1.2.3干细胞移植分别在模型制备成功后1 d，1, 2和4 wk时，将1 mL细胞悬液通过尾静脉注射到各不同干细胞移植组大鼠体内，对照组则在模型制作成功1 d后注射1 mL无血清DMEM培养液. 饲养4 wk后，行左心功能测定.

　　1.2.4左心室功能测定30 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（1.5 mL/kg）大鼠，分离右侧颈总动脉，显微镜下插入内充肝素生理盐水的塑料管至左心室腔，用多道生理记录仪记录左心室收缩舒张压差（LVSEDP）和左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)以反映左心室收缩与舒张功能. 所有电信号均用机软件分析处理.

　　1.2.5心肌缺血和梗死面积的测量［5］测定左心功能后，从左心室导管推注伊文氏蓝2 mL，5 min后迅速剪下心脏，冻存于-20℃. 用心脏切片器垂直于心脏长轴切成1 mm厚的薄片， 置于含TTC的培养皿中，37℃孵育15 min. 用数码相机拍照并输入计算机. 采用单盲法分别将伊文氏蓝染色区（蓝染，非缺血区）、TTC染色区（缺血但仍存活组织）以及非TTC染色区（苍白色，梗死心肌）用SigmaScan面积测算软件进行计算处理. 缺血范围以每一心脏总梗死面积（INF）占总缺血面积的（AAR）的百分比表示.

　　统计学处理： 试验数据用x±s表示； 多组比较采用单因素方差分析， 用LSDt检验做多重比较， 所有数据均用SPSS软件处理,检验水准设为0.05（双侧）.

　　2结果

　　2.1MSCs的形态观察细胞培养24 h后发现细胞浓度很大，大部分为大鼠骨髓中的红细胞；多次换液后悬浮于培养液中的红细胞基本去除，只留下贴壁生长的MSCs，呈细而小的长梭形或多边形，以集落方式增殖.

　　2.2心肌梗死模型的鉴定急性心肌梗死模型制作后4 wk观察心脏大体标本，可见瘢痕形成，心肌组织HE染色示梗死组织周围心肌组织紊乱，梗死处心肌细胞消失，代之以纤维瘢痕组织.

　　2.3心脏左心功能测定1 d移植组左室各心功能指标与对照组无明显差异（P＞0.05），而1, 2, 4 wk移植组与对照组对比心功能各指标均有改善（P<0.05），其中2 wk组的左室心功能改善最显著，优于1 wk组和4 wk组（P<0.05,表1）.

　　表1各移植组和对照组左室心功能的比较（略）

　　2.4心肌缺血和梗死范围1 d移植组的缺血范围（AAR/LV×100%）和心肌梗死范围（INF/AAR×100%）与对照组比较无明显差异［（41±4）%和（50±6）% vs （40±5）%和（51±4）%，P＞0.05，n=10］；而1 wk移植组［(36±4)%和(47±5)%］，2 wk移植组［(32±3)%和(43±4)%］，4 wk移植组［(37±4)%和(46±5)%］的缺血范围和心肌梗死范围均明显小于对照组和1 d移植组（P<0.05，n=10）；其中2 wk移植组与1 wk移植组，4 wk移植组比较缺血范围和梗死范围更小（P<0.05，n=10）.

　　3讨论

　　心肌梗死后出现大量心肌细胞坏死和凋亡，心肌组织中的急、慢性炎症反应相继发生，而不同炎症微环境对于移植细胞的存活及分化的影响直接决定着移植时机的选择以及移植细胞的存活.
　　
　　我们的实验发现，心肌梗死后1 d（即急性期），进行骨髓干细胞移植，饲养4 wk后观察，左室各心功能指标与对照组相比无显著差异，心肌缺血和梗死范围亦无明显缩小；而心肌梗死后1~2 wk（即亚急性期），进行骨髓干细胞移植，左室心功能指标明显改善，心肌缺血和梗死范围与对照组和1 d移植组相比明显缩小，其中2 wk移植组心功能改善尤为明显；而梗死后4 wk（即陈旧期），进行骨髓干细胞移植，效果亦优于1 d移植组，但不如2 wk移植组效果显著. 这种改变可能与细胞移植之前心脏本身发生的变化有关. 心肌梗死形成后的第一个48 h内是急性炎症反应期，在此期间进行细胞移植，植入的骨髓干细胞更多的是参与了炎症反应而不是参与心肌与血管再生，因而不利于移植细胞的生长，这是因为：①在急性反应期，白介素8(IL8)吸引中性粒细胞向梗死区移动. 移动到梗死区的中性粒细胞通过释放蛋白水解酶发挥强大的细胞毒作用［6］，可以对移植细胞进行攻击. ②参与急性炎症反应的中性粒细胞及巨噬细胞将坏死细胞与移植细胞共同清除. 而在心肌梗死的亚急性期，此时，心脏处于修复期，浸润的单个核细胞，能够释放一系列细胞因子和生长因子［7］； Sockit等［8］的研究发现心肌梗死后1～2 wk，缺血心脏自身促血管新生因子如VEGF, bFGF等的分泌达到高峰，此时心脏自身促血管生成因素能够放大移植的骨髓干细胞促血管生成效应，更有利于缺血心脏修复. 而在心肌梗死的陈旧期，瘢痕已经形成，瘢痕的扩展和变薄也已经完成，炎症反应已消退，缺血心脏释放的细胞因子和血管生长因子明显减少，此时进行细胞移植引起的效应可能主要来自移植的骨髓干细胞本身，故此时移植引起的心功能的改善和缺血梗死范围的减少不明显. Li等［9］在心肌梗死后即刻, 2 wk, 4 wk经心外膜移植乳鼠心肌细胞至瘢痕中央，观察2 mo后，发现即刻移植组并不引起心功能和瘢痕大小的明显改善；而2 wk移植组和4 wk移植组则可明显改善心功能和瘢痕大小，且2 wk移植组比4 wk移植组改善更明显，这与我们的实验结果基本吻合. 因此我们认为在心肌梗死后1～2 wk亚急性期，炎症反应消退后，瘢痕扩展之前进行细胞移植引起的心脏功能改善和梗死面积减少效果最好.
　　
　　目前干细胞移植的方法主要有：①经心肌梗死相关区冠状动脉注射；②心肌梗死区直接注射；③经静脉注射. 然而前两种方法需要二次开胸，手术难度较大，而且对身体的创伤也大. 我们的实验采用了静脉注射，只需一次开胸，方法更简单，也取得了预期的效果. 但究竟那种移植方法更好，目前的实验研究还不充分，还有待于更进一步的研究.

　　【】

　　［1］ Yau TM, Tomita S, Weasel RD, et al. Beneficial effect of autologous cell transplantation on infracted heart function: Comparison between bone marrow stromal cells and heart cells［J］. Ann Thorac Surg, 2003,75:169-176.

　　［2］ 张少衡，郭静萱，周春燕，等. 骨髓干细胞移植心肌梗死的研究进展［J］. 中华心血管病杂志，2003，31：231-232.

　　［3］ Makino S, FuKuda K, Miyoshi S, et al. Cardiomyocyte can be generated from marrow stromal cell in vitro［J］. J Clin Invest,1999,103:697-705.

　　［4］  Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Mobilized bone marrow cell repair the infarcted heart improving function and survival［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):10344-10349.

　　［5］ 武峰，王海昌，王跃民，等. 动员自体骨髓干细胞对急性心肌缺血大鼠心功能的影响［J］. 第四军医大学学报，2005，26: 297-299.

　　［6］ Rangogiannis NG, Smith CW, Mark LE. The inflammatory response in myocardial infarction ［J］. Cardiovasc Res, 2002,53:31-47.

　　［7］ Rangogiannis NG，Mendoza LH, Lewallen M,et al. Induction and suppression of interferoninducible protein 10 in reperfused myocardial infarcts may regulate angiogenesis［J］. FASEB J,2001,15:1428-1430.

　　［8］ Sockit T, Tamura Y, Shinohara H, et al. Senial Changes in serum vEGF and HGF in patients with acute myocardial infarction［J］. Cardilology, 2000,93:168-174.

　　［9］ Li RK, Donald AG, Richard DW, et al. Optimal time for cardiomyocyte transplantation to maximize myocardial function after left ventricular injury［J］. Ann Thorc Surg, 2001, 72:1957-1963.