细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF

               作者：唐俊明,郭凌郧,孔霞,杨建业,潘国栋,陈龙,黄永章,王家宁

【关键词】  同源重组；人基质细胞源衍生因子

　　Construction of recombinant adenoviral plasmid bearing hSDF1α cDNA by homologous recombination in bacteria and preparation of recombinant adenovirus expressing hSDF1α

　　【Abstract】 AIM： To construct recombinant adenoviral plasmid containing hSDF1α cDNA using homologous recombination in bacteria and to prepare recombinant adenovirus expressing hSDF1α. METHODS: Adenoviral backbone plasmid was transformed into competent BJ5183 and the competent BJ5183 transformed with pAdEasy1 was prepared. The linearized  pShuttleEGFPhSDF1α plasmid with Pme I digestion and CIAP dephosphorylation was transformed into the competent cells BJ5183 transformed with pAdEasy1. The identified recombinant adenoviral plasmid pAdEGFPhSDF1α was digested with Pac I and transfected into AD293 cells with cationic liposome LipoVec to package recombinant adenovirus AdEGFPhSDF1. AdEGFPhSDF1α was propagated by repeated rounds of infection of AD293 cells with supernatant of the recombinant adenovirus. AdEGFPhSDF1α was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. RESULTS: pShuttleEGFPhSDF1α was successfully transformed into competent BJ5183 transformed with pAdEasy1 and homologous recombination between pAdEasy1 and pShuttleEGFPhSDF1α took place within BJ5183 bacteria. Liposomemediated  transfection of pAdEGFPhSDF1α digested with Pac I into AD293 cells was performed. The packaging of recombinant adenovirus AdEGFPhSDF1α within AD293 cells was confirmed by fluorescent microscopy. The viral titer was 4.1×1015 pfu/L. CONCLUSION: The recombinant adenovirus expressing hSDF1α was prepared successfully by a simple and rapid homologous recombination in bacteria. This study provides a basis for exploring the migration mechanism of bone marrowderived stem cells into injured tissue such as infarcted myocardium.

　　【Keywords】 homologous recombination； hSDF1α； adenovirus； gene therapy

　　【摘要】 目的：利用细菌内同源重组快速构建携带hSDF1α cDNA重组腺病毒质粒和制备表达hSDF1α重组腺病毒. 方法： 制备感受态BJ5183，将pAdEasy1转化BJ5183，制备含pAdEasy1的BJ5183感受态，将线性化的pShuttleEGFPhSDF1α转化含pAdEasy1的BJ5183感受态菌. 采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdEGFPhSDF1α. pAdEGFPhSDF1α用Pac I线性化后，再用LipoVec介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEGFPhSDF1α. 采用荧光显微镜下观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况. 结果：pShuttleEGFPhSDF1α成功地转化了含pAdEasy1的BJ5183，并在其内发生了同源重组. 荧光显微镜下观察证实了pAdEGFPhSDF1α转染AD293后，产生了重组腺病毒AdEGFPhSDF1α. 病毒滴度为4.1×1015 pfu/L. 结论：用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达hSDF1α的高滴度重组腺病毒. 为研究hSDF1α在动员骨髓源干细胞迁移到组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.

　　【关键词】 同源重组；人基质细胞源衍生因子1； 腺病毒；基因

　　0引言
　
　　基质细胞源衍生因子1(stromal derived factor1, SDF1)属CXC型趋化因子. 同基因编码两种蛋白:SDF1α和SDF1β,其受体CXC型趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4, CXCR4）是一个具有7个跨膜结构域的G蛋白耦联的受体［1］. 研究发现SDF1α是CD34+造血干细胞的趋化因子,CD34+造血干细胞能沿SDF1浓度梯度向骨髓迁移实现归巢［1-3］. 同时,SDF1在骨髓动员中也发挥了重要作用［4-6］. 而已知骨髓内除了含有造血干细胞外,至少还含有内皮祖细胞、间充质干细胞. 近来研究表明移植的内皮祖细胞、间充质干细胞通过参与或促进血管新生和心肌再生而明显改善了受损心脏的功能. 但是国内外关于hSDF1α动员骨髓源内皮祖细胞、间充质干细胞的作用研究很少,尤其hSDF1α在心肌梗死后动员骨髓源间充质干细胞靶向迁移到心梗部位的作用研究更是甚少. 因此,为进一步探索hSDF1α在骨髓动员、迁移中的作用,非常有必要制备表达hSDF1α的重组腺病毒.

　　1材料和方法

　　1.1材料① 质粒与菌株：pORFhSDF1α质粒、脂质体LipoVec购自Invivogen公司；腺病毒骨架质粒pAdeasy1,穿梭质粒pShuttleIREShrGFP2，AD293，BJ5183和XL10gold购自Stratagene公司；pGEMT Easy vector购自Promega公司；DH5a由郧阳医学院临床医学研究所保存; ② 限制性内切酶：EcoR V，Xho I，Pac I和Pme I购自New England Biolabs公司；λDNA Hind Ⅲ marker, 200 bp DNA ladder, dNTP, Taq酶、T4 DNA连接酶购自华美生物工程公司；hSDF1α cDNA扩增引物：上游引物为5′ GAT ATC ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC 3′,下游引物为5′ CTC GAG TTA CTT GTT TAA AGC TTT CTC 3′由北京赛百盛生物公司设计合成,上游、下游引物5′端分别带有EcoR V, Xho I位点; ③ 仪器:高速冷冻离心机(UNIVERSAL 32R,德国),超速冷冻离心机(Hitachi，CP8OMX，日本),倒置相差荧光显微镜(Nikon，TE2000U，日本),PCR仪(Biometra, 德国),紫外/可见光分光光度计(Cecil，CE2041，英国), 台式高速冷冻离心机、水浴摇床等.

　　1.2方法

　　1.2.1hSDF1αcDNA的扩增以pORFhSDF1α为模板,20 mmol/L的上下游引物各5 μL, pfu DNA聚合酶1 μL, 10×buffer 5 μL, 10×dNTP 5 μL,加双蒸水至总反应体积50 μL. 进行聚合酶链（polymerase chain reaction, PCR）反应：起始变性94℃ 5 min,然后执行94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 30次循环,最后72℃延伸10 min.

　　1.2.2“T”连接反应参照本所已建立的方法［7-8］,将回收纯化的279 bp PCR产物,加入10×PCR buffer 5 μL, 10×MgCl2 5 μL, 2 mmol/L dATP 2 μL, Taq酶2 μL,加双蒸水至总反应体积50 μL,72℃孵育30 min. 回收纯化加“A”后的hSDF1α cDNA片断（281 bp）,加10×T4 DNA连接buffer 5 μL, pGEMT Easy vector 0.5 μL,T4 DNA连接酶1 μL,加双蒸水至总反应体积10 μL,室温连接3 h. 将连接产物转化DH5α,涂布含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB琼脂培养基上培养12 h,蓝白筛选,挑选白色单菌落接种于含氨苄青霉素（100 mg/L）的TB培养基中培养12 h,提取质粒EcoR V和Xho I酶切鉴定. 重组质粒命名为pGEMThSDF1α.

　　1.2.3穿梭质粒pShuttleEGFPhSDF1α的构建将pShuttleIRESHrGFP2和pGEMhSDF1α分别用EcoR V/Xho I双酶切后，低熔点琼脂糖凝胶电泳，分别回收8.8 kb的穿梭质粒片段和279 bp的hSDF1α cDNA，用T4连接酶连接过夜. 然后转化感受态DH5a,小量培养,经酶切鉴定正确后大量培养,抽提质粒DNA备用.

　　1.2.4pAdEGFPhSDF1α重组腺病毒质粒的制备取1.0 μg的腺病毒骨架质粒pAdeasy1转化感受态BJ5183,挑取含pAdeasy1的BJ5183菌,大量扩增后制备含pAdeasy1的超感受态BJ5183. pShuttleEGFPhSDF1α经Pme I酶切24 h后,直接用无水乙醇沉淀DNA,再用碱性磷酸酶(CIAP) 50℃， 30 min去磷酸化,经7 g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳,回收线性化去磷酸化的pShuttleEGFPhSDF1α,经酚、氯仿抽提后转化含pAdeasy1的超感受态BJ5183. 挑3个单克隆菌落,小量培养,碱裂解法小量提取质粒,经PacI酶切,7 g/L琼脂糖凝胶电泳,若出现一大于23 kb和4.5 kb或3.0 kb的特征性条带,即为阳性质粒. 将重组的pAdEGFPhSDF1α在XL10gold中大量扩增.

　　1.2.5重组腺病毒的包装、扩增、纯化、滴度测定及鉴定重组腺病毒质粒pAdEGFPhSDF1α经PacI酶切后，采用脂质体LipoVec介导转染Ad293细胞. 于转染后不同时间用普通倒置相差显微镜和荧光显微镜分别观察细胞的病理变化及是否出现绿色荧光. 若出现绿色荧光及细胞变圆，说明已有病毒包装. 当出现90％细胞病变时，将293细胞自培养瓶中刮下，-80℃～37℃反复冻融3次裂解细胞，离心取含病毒的上清，重新感染293细胞，大量扩增病毒. 重组腺病毒的纯化参照王家宁等［9］的方法. 将透析纯化后的腺病毒采用紫外分光光度计进行滴度测定. 取纯化后的病毒液100 μL，10 g/L SDS 20 μL，PBS 880 μL，测定病毒基因组DNA的A260 nm和A280 nm，据此病毒的颗粒数和纯度，1 A260 nm=1015 pfu/L，pfu/L=A260 nm×dilution×10，A260 nm/A280 nm>1.3表明病毒纯度较高. 重组腺病毒AdEGFPhSDF1α的PCR鉴定：自病毒上清液中提取重组腺病毒基因组DNA作为模板，扩增目的基因，若出现279 bp的预期片段，说明携带hSDF1α的重组腺病毒.

　　2结果

　　2.1hSDF1αcDNA的扩增2 g/L琼脂糖凝胶电泳可见特异性279 bp扩增片断（图1）.

　　图1hSDF1α cDNA扩增产物电泳结果　略

　　2.2pGEMThSDF1α的酶切鉴定及测序结果pGEMThSDF1α经EcoR V和Xho I双酶切,2 g/L琼脂糖凝胶电泳可见279 bp片断（图2），说明hSDF1α cDNA已经成功地插入T载体上. 将构建的pGEMThSDF1α重组质粒送北京华大生物科技有限公司进行测序,其序列与hSDF1α基因供应商Invivogen公司提供的序列完全一致.

　　图2pGEMThSDF1α酶切鉴定　略

　　2.3穿梭质粒pShuttleEGFPhSDF1α的鉴定hSDF1αcDNA自pGEMThSDF1α中经EcoR V和Xho I双酶切,亚克隆入经同样酶切的穿梭质粒pShuttleIRESHrGFP2中,形成穿梭质粒pShuttleEGFPSDF1α. 经EcoR V和Xho I酶切后获得8.8 kb和279 bp两条带,证明目的基因已成功插入到穿梭质粒pShuttleIRESHrGFP2（图3）.

　　图3pShuttleEGFPhSDF1α的酶切鉴定　略

　　2.4重组腺病毒质粒(pAdEGFPhSDF1α)的酶切鉴定pShuttleEGFPhSDF1α和pAdeasy1转化BJ5183细菌后,含有重组质粒的细菌可在含卡那霉素的培养基中生长形成克隆. 挑取克隆,小量抽提质粒DNA. 用Pac I酶切,重组腺病毒质粒出现一大于23 kb和4.5 kb的片段,说明pAdeasy1与pShuttleEGFPhSDF1α在复制起始位点与右臂之间发生了同源重组(图4).

　　图4pAdEGFPhSDF1α的酶切鉴定　略

　　2.5pAdEGFPhSDF1α转染的AD293细胞的荧光显微镜镜下观察正常的AD293细胞呈多角形，界限清晰，分布均匀. 在LipoVec介导的Pac I酶切的pAdEGFPhSDF1α转染AD293细胞14 d后,pAdEGFPhSDF1α转染的AD293细胞14 d后在倒置显微镜下可见细胞肿胀，变圆，聚集成团，呈典型葡萄串样改变等典型的腺病毒感染AD293细胞后的病变情况. 荧光显微镜镜下观察，可见大量的克隆呈绿色荧光，说明LipoVec可有效介导重组病毒质粒的转染，也说明在AD293细胞中有重组腺病毒的包装，并能表达hSDF1α(图5).

　　图5pAdEGFPhSDF1α转染的AD293细胞的显微镜观察×100　略

　　2.6重组腺病毒滴度测定重组腺病毒经包装、扩增、纯化后经紫外分光光度计测定，病毒滴度为4.1×1015 pfu/L，A260 nm/A280 nm=1.451>1.3，说明病毒滴度较高，可满足在体基因治疗的需要，且纯度较高.

　　2.7重组腺病毒AdEGFPhSDF1α的PCR鉴定以提取的病毒DNA为模板进行PCR反应，2 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果出现了279 bp的特异性片段，说明病毒AdEGFPhSDF1α包装成功(图6).

　　3讨论

　　已知SDF1及其受体CXCR4是骨髓源干细胞迁

　　图6AdEGFPhSDF1α的PCR鉴定　略

　　移归巢到骨髓、肝脏、脑等组织损伤部位所必需信号分子［10-11］. 我们为探索hSDF1α在动员骨髓源干细胞迁移到心肌梗死部位的作用,急需制备表达hSDF1α的重组腺病毒. 重组腺病毒是基因转移和基因表达的有效工具,腺病毒既可感染静止期细胞又可感染分裂期细胞,并能获得高滴度病毒和高效基因表达,用于基因的腺病毒一般都是E1和E3区基因的复制缺陷性2型或5型重组腺病毒,此复制缺陷性病毒的复制、扩增需要293细胞,293细胞是一种转化了E1区的人胚肾细胞,能编码腺病毒的E1区. 在293细胞中产生的复制缺陷性腺病毒颗粒能感染许多类型的细胞,并表达所插人的外源基因,但不能在感染的细胞中复制. 这种E1区缺失的腺病毒既能避免本身对宿主细胞的损害,同时又达到基因治疗的目的. 重组腺病毒介导的基因转移并不插人到宿主细胞染色体中,故无激活致癌基因或插入突变的危险等优点. 腺病毒是目前基因治疗和临床研究中使用较广泛的载体之一［12-13］.
　　
　　我们用PCR的方法获得hSDF1α的cDNA片段,并在它两端添加匹配的限制性内切酶位点以便于DNA重组的操作. 由于Taq酶在PCR时有一定的误掺率,本实验目的基因扩增中我们采用了高保真的pfu酶代替Taq酶进行PCR扩增,保证了PCR扩增的hSDF1α cDNA片段的准确性,在PCR完成后利用Taq酶非模板依赖性末端转移酶特性对PCR产物进行加“A”反应,选用了3′末端带单个“T”的T载体作为中间载体,利用了T/A高效互补,成功构建了含两端带有特定酶切位点的hSDF1αcDNA的重组质粒pGEMThSDF1α.
　　
　　我们构建腺病毒载体的穿梭质粒pShuttleIRESHrGFP2中构建元件已插入增强性GFP表达盒,因此重组腺病毒载体在293细胞的包装过程中很容易通过荧光显微镜观察是否已包装入细胞;在重组腺病毒介导hSDF1α基因感染细胞时,易观察到hSDF1α基因是否已转入细胞,及是否表达hSDF1α.
　　
　　重组腺病毒制备的技术关键是同源重组和对重组体的筛选、鉴定［9］. 传统的细胞内同源重组法是将腺病毒骨架质粒和携带目的基因的穿梭质粒共转染293细胞，这一方法要求两种质粒同时转移至同一293细胞中，并在该细胞中发生同源重组. 由于两种质粒转染同一293细胞的可能性很小，发生同源重组的机率就更小. 提高同源重组率是制备腺病毒一直致力要解决的首要问题. 本研究我们采用了细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒质粒，与传统方法不同的是两种质粒的转染和同源重组都是在BJ5183菌中完成［14］. 由于质粒转化细菌的效率极高，细菌繁殖速度快，BJ5183菌中的RecA具有很强的重组活性，因此细菌中同源重组法克服了细胞内质粒共转染效率低和同源重组率低的缺点. 本研究我们采用pAdEasy1先转入BJ5183菌中，制备含pAdEasy1的感受态BJ5183，再将线性化的pShuttleEGFPhSDF1α转入该菌，同源重组后pShuttleEGFPhSDF1α的耐卡那抗性基因被重组进去，而pAdEasy1的耐氨苄抗性被重组除去，发生了同源重组的细菌在Kan+平板上能生长，而未发生同源重组的细菌不能在Kan+平板上生长. 成功重组的腺病毒质粒在XL10gold菌中扩增、提取后，用Pac I酶切，除去Kan和Ori载体构件，暴露反向末段重复序列，回收目的片断，用阳离子脂质体LipoVec转染AD293细胞，包装产生重组腺病毒AdEGFPhSDF1α，这样就省却了细胞内同源重组法对所产生的重组腺病毒必须进行的多轮费时、费力的筛选鉴定，大大缩短了实验周期，且显著提高了成功率.
　　
　　重组腺病毒AdEGFPhSDF1α经浓缩纯化后，滴度达到了4.1×1015 pfu/L，A260／A280 nm>1.3. 说明采用此方法制备的重组腺病毒，滴度较高，纯度较好，可满足在体基因转移的需要. 为今后hSDF1α基因在组织损伤部位高表达动员骨髓源干细胞治疗心肌梗死等人类疾病的研究奠定了基础.

　　【】

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