胆总管结石的成因观察

                            作者：陈晓文，智发朝，曹东林，周思朗，陈勇伟,谢栋

【关键词】  胆总管

　　Experimental studies on causes of calculus formation in common bile duct

　　【Abstract】 AIM: To observe the roles of bacterial infections, gastrointestinal hormones and bile biochemical factors during calculus formation in the common bile duct. METHODS:  In this study, 72 patients were divided into 2 groups: CBDS group (56 patients with common bile duct stone) and NCBDS group (16 patients with obstruction of common bile duct but without CBDS). Bile aspirated by ERCP from all the patients was cultured aerobically and the contents of TBA, Ca2+, P2+ and CHO in the bile were detected. Stones of 11 patients aspirated by ERCP were inspected for E.coli by PCR. The serum motilin (MTL) and the somatostatin (SS) were measured by radioimmunoassay in 52 patients. RESULTS:  53 patients (95%) of CBDS group and 8 patients (50%) of NCBDS group were positive in biliary germicultures. Infection rate in CBDS group was significantly higher than that in NCBDS group (P<0.05). Three (27%) of 11 patients who had a PCR examination had positive results. The serum motilin level of the patients in CBDS group was significantly lower compared with that of the patients in NCBDS group (202±151 vs 315±161) ng/L, while the serum somatostatin and bile Ca2+ level of CBDS group were significantly higher than those of NCBDS group ［(15±5 vs 12±3) ng/L, (1.4±0.9 vs 0.7±0.3) mmol/L, P<0.05］. TBA level of CBDS group was significantly lower than that of NCBDS group ［(12±6 vs 16±7) nmol/L, P<0.05］CONCLUSION:  The changes of biochemical characteristics in the bile, the disorders of modulating action of gastrointestinal hormones and the bacterial infections may be the risk factors of common bile duct stones.

　　【Keywords】 common bile duct calculi；bacteria；motilin；somatostatin；bile；biochemistry

　　【摘要】 目的：探讨细菌感染、胃肠激素及胆汁生化在胆总管结石形成中的作用. 方法：实验分为胆总管结石(CBDS)组(n=56)、非结石胆总管梗阻(NCBDS)对照组(n=16). ① 内窥镜下逆行胰胆管造影术(ERCP)中抽取胆汁作需氧菌培养及进行总胆汁酸(TBA), Ca2+, P2+和胆固醇(CHO)测定. ② ERCP术中取结石用PCR法行结石大肠杆菌检测. ③采静脉血行胃动素及生长抑素检测. 结果：① CBDS组56例胆汁标本需氧菌培养中，有53例检出细菌(95%)，NCBDS组16例胆汁标本中，有8例检出细菌(50%)，两组细菌检出率比较有统计学意义（P<0.05）. 用PCR方法对11例CBDS患者结石进行大肠杆菌DNA片段检测，3例出现阳性(27%). ② CBDS组血浆胃动素水平较NCBDS组明显偏低(202±151 vs 315±161) ng/L，而生长抑素则明显升高(15±5 vs 12±3) ng/L，组间比较差异显著（P<0.05）. ③ CBDS组胆汁中Ca2+显著高于NCBDS组［(1.4±0.9 vs 0.7±0.3) mmol/L, P<0.05］,TBA则显著低于NCBDS组［(12±6 vs 16±7) nmol/L, P<0.05］. 结论：胆汁理化性质改变、胆道感染及胃肠激素紊乱在胆管结石形成中可能具有重要作用.

　　【关键词】 胆总管结石；细菌；胃动素；生长抑素；胆汁；生化

　　0引言

　　近年来，胆道细菌感染在棕色结石形成中的作用成为人们关注的焦点之一. Steward等［1］运用扫描电镜首次证实棕色结石中存在细菌，Tabata等［2］检测发现100%胆总管棕色结石中可检出细菌，提示细菌在胆总管结石(common bile duct stone, CBDS)形成中扮演重要作用；也有学者认为，胆结石形成可能与胆道动力异常和胆汁淤滞有关；近年来研究表明，改变胆汁酸组成和酸碱度可影响胆汁中胆红素及钙离子浓度，二者浓度过高，在胆汁中不能充分溶解，可促进胆汁核化和结石形成. 我们对胆总管结石患者菌群、激素水平及胆汁生化进行观察，以探讨其在胆总管结石形成中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料①仪器设备： BECKMAN DU600型核酸蛋白质分析仪，美国Beckman Coulter公司；JM250型电泳仪，大连捷迈科贸有限公司；Model 60全自动微生物鉴定仪，特康科技有限公司；Olympus AU800型全自动生化分析仪，日本Olympus公司；SN682型放射免疫γ计数器，上海核福光仪器有限公司；PERKIN ELMER 480型DNA扩增仪，美国PERKINELMER公司；SANYO MDFU50V超低温冰箱，日本SANYO公司；UVI Tec凝胶成像系统，英国UVI Tec公司；TGL16G台式高速冷冻离心机，上海安亭仪器厂；电热恒温培养箱，广州医疗设备厂. ②试剂： DNA Maker，大连宝生物技术有限公司；dNTP，上海生物工程技术服务有限公司；Taq DNA聚合酶，河南华美生物工程公司；胆汁酸HR Wako，日本和光纯药株式会社；生长抑素及胃动素放射免疫检测试剂盒，解放军总科技开发中心放免所；细菌基因组DNA提取试剂盒，北京赛百盛公司.

　　1.2对象实验组：2002年南方医院就诊CBDS（同时需排除胆囊结石或肝内胆管结石）患者56（男29，女27）例，年龄22~82(平均57±15)岁. 所有患者均通过腹部B超、CT或MRI检查，最后经内窥镜下逆行胰胆管造影术(endoscopic retrograde choledochopancreatography, ERCP)证实. 近期均未服用影响胃肠道动力的药物. 对照组：2002年南方医院就诊非结石胆总管梗阻(not common bile duct stone, NCBDS)患者16（男7，女9）例，年龄25~86(平均55±15)岁. 所有患者均通过腹部B超、CT或MRI检查证实胆总管扩张，ERCP证实胆总管内无结石. 近期均未服用影响胃肠道动力的药物. 两组性别年龄比较差异无统计学意义.

　　1.3方法

　　1.3.1需氧菌培养患者行ERCP检查，注射造影剂前应用无菌导管入胆道，抽吸胆汁2 mL，并接种在血平板上，37℃恒温箱中进行常规培养，48 h观察结果，用Model 60型全自动微生物鉴定仪进行鉴定.

　　1.3.2大肠杆菌DNA检测ERCP下取胆石标本(n=11)，用无菌生理盐水冲洗三次，放入无菌试管中置于-20℃冰箱中备用. 参照Dong等［3］方法，采用PCR扩增大肠杆菌DNA片段. PCR体系如下：常规配制含DNA模板1.5 μL，引物序列参照Dong等［3］报道，由上海生物工程技术服务有限公司合成，上游引物：5′TCTCTATGTGCATACGGAG3′，下游引物：5′CCATACTGATTGCCGCAA3′. PCR循环条件：94℃ 3 min，94℃ 60 s，65℃ 30 s，72℃ 45 s， 35个循环后72℃延伸5 min. 用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，扩增片段长度为320 bp.

　　1.3.3胆汁胃动素和生长抑素的放射免疫检测用预冷的注射器抽取患者（由于部分患者不配合，实际参与实验人数CBDS组n=41, NCBDS组n=12)空腹静脉血2 mL，置于含30 μL（2×103万U/L）抑肽酶的预冷试管中，4℃低温离心15 min (4000 r/min)，取血浆分装于2个Eppendorf管内，每管约0.5 mL，编号后冻存于-78℃低温冰箱保存待测. 检测方法参照试剂盒说明书进行.

　　1.3.4胆汁生化检测指标ERCP术中，注射造影剂前抽吸胆汁5 mL，离心5 min (4000 r/min)，取上清，用Olympus AU 800全自动生化分析仪对胆汁中总胆汁酸(total bile acid, TBA)，Ca2+，P2+，胆固醇(cholesterol, CHO)进行检测，其中Ca2+用MXB法，TBA用酶比色法，P2+用钼酸直接法，CHO用酶法.

　　统计学处理： 细菌结果用统计软件SPSS 11.0对数据进行卡方检验. 胃肠激素检测数据采用x±s表示，作方差分析. 胆汁生化指标用x±s表示，用两样本均数t检验进行统计分析.

　　2结果

　　2.1胆汁需氧菌培养及菌种分析

　　2.1.1两组患者胆汁细菌培养CBDS 56例胆汁标本需氧菌培养53例检出细菌，检出率为95%，15例检出 2种细菌，共获68株细菌. 其中革兰氏阴性杆菌50株，占74%；革兰氏阳性球菌17株，占25%；霉菌1株，占1%. NCBDS 16例有8例检出细菌，检出率为50%，其中3例检出2种细菌，共获11株细菌. 埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属和肠球菌属为胆道主要致病菌.

　　2.1.2结石中大肠杆菌DNA检测用PCR法分析11例CBDS患者结石，其中3例扩增出大肠杆菌基因片段，与标准大肠杆菌菌株DNA阳性对照带位置相同，形态一致. 其余8例无条带出现，扩增结果阴性，未发现大肠杆菌DNA片段存在，重复三次，结果一致(图1).

　　2.2两组血浆胃动素及生长抑素检测CBDS组血浆胃动素水平较NCBDS组明显偏低（202±151 vs 315±161）ng/L，而生长抑素水平较NCBDS组明显升高（15±5 vs 12±3）ng/L，有统计学意义(P<0.05）.

　　2.3两组胆汁生化测定CBDS组胆汁中Ca2+水平较 NCBDS组明显增高(P<0.05)，TBA较NCBDS组明显降低(P<0.05)，两组间比较有统计学意义(P＜0.05），P2＋和CHO则无显著性差异（表1）.表1两组患者胆汁生化测定结果(略)

　　3讨论

　　正常情况下胆总管内无细菌生长，据［4］报道，在并发胆道感染时胆汁中可培养出一种或多种致病菌株，这些致病菌几乎都来自肠道，多为条件致病菌. 内镜下经导管抽吸胆汁进行细菌检测，国内已有较多报道，但有学者对其结果的可靠性提出异议. 本实验56例CBDS胆汁标本细菌检出结果与国内报道类似［5］. 本实验中，同样在胆道梗阻情况下，两组患者胆汁细菌培养阳性率差异显著，而混合感染率比较无统计学意义，提示胆道梗阻是合并感染、特别是混合感染的一个诱发因素，而不是唯一原因. 同时这些结果也表明CBDS患者较其它原因引起的胆道梗阻更易出现感染，间接提示胆道长期细菌感染可能与结石形成有关.

　　据报道，棕色结石细菌检出率可达90%以上，但取棕色结石作细菌培养，通常得不到细菌存在的直接证据，PCR技术可大大提高结石中细菌的检出率. 本组11例患者结石中，3例发现存在大肠杆菌DNA片段. 提示PCR技术可提高胆石中细菌感染检测的敏感性.

　　有学者用电镜和PCR方法证实，胆汁或结石不同层面可出现不同细菌或菌株，说明细菌在结石形过程中扮演一定角色，有可能在结石形成前已有细菌感染，其机制可能是与细菌产生β葡萄糖醛酸酶及磷酯酶有关. 细菌感染还可使胆管上皮细胞分泌紊乱，引起急慢性胆管炎、胆管运动功能障碍、胆汁瘀积、沉淀形成. 细菌代谢产物如聚多糖及黏蛋白可使细菌间相互黏附在一起，形成菌膜(biofilm)，对于棕色结石起凝聚和支架作用，成为结石核心. 胆道感染易造成胆道梗阻，而胆道梗阻又加重胆道感染，如此形成恶性循环，加快结石形成.

　　本实验结果显示，CBDS组血浆胃动素水平较NCBDS明显偏低，而生长抑素水平较NCBDS明显升高，提示胃肠激素紊乱与胆道结石形成有关. 动物实验研究表明，豚鼠体内胃肠激素在胆汁淤滞尚未发生之前已发生改变，提示胃肠激素的改变可能是导致胆汁代谢障碍的影响因素之一；CBDS组胆汁中TBA较NCBDS组明显降低，胆汁Ca2+浓度明显增高. 胆汁中TBA降低，不能有效地溶解游离胆红素及胆固醇，不能有效地与胆汁中Ca2+结合形成可溶性钙盐，使Ca2+浓度增高，而胆汁中Ca2+浓度增高，为非结合胆红素钙、软脂酸盐及硬脂酸盐增高提供了底物，导致胆汁中较易形成微胶粒，微胶粒达过饱和后形成结晶析出，最终导致结石形成.  两组胆汁中CHO无明显差异，说明棕色结石形成与CHO无明显关系，这与CBDS主要为棕色结石，其成分主要为胆红素钙相符.

　　【文献】

　　［1］ Steward l, Smith AL, Pellegrini CA, et al. Pigment gallstones form as a composite of bacterial microcolonies and pigment solids［J］.Ann Surg,1987, 206(3):242-250.

　　［2］ Tabata M, Nakayama F. Bacteria and gallstones:Etiological significance［J］. Dig Dis Sci， 1981，26(3):218-224.

　　［3］ Dong KL,Phillip IT. Bacterial DNA in mixed cholesterol gallstones［J］. Gastroenterology,1999,94(12)：3052-3056.

　　［4］ Leung JW，Liu YL，Lau GC，et al. Bacteriologic analyses of bile and brown pigment stones in patients with acute cholangitis［J］. Gastrointest Endosc, 2001,54(3)：340-345.

　　［5］ 周平红，姚礼庆，徐美东. 胆道感染病原菌的调查与耐药分析［J］. 临床医学，2001,8(6):448-450.