含有非甲基化CpG的双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

                                                      作者：安蔚，赵苗青，李雅林，李松，康莉，宋文刚

【关键词】  甲基化

　　Stimulatory effect of bifidobacteria DNA containing unmethylated CpG motifs on maturation of bone marrowderived dendritic cells

　　【Abstract】 AIM:  To explore the effect of bifidobacteria DNA containing unmethylated CpG motifs (CpG DNA) on the maturation of bone marrowderived dendritic cells (BMDC). METHODS:  The genomic DNA of bifidobacteria was extracted and purified, and the methylated degree of CpG motifs was tested. Cell phenotypes and antigens uptake of BMDC were analyzed by flow cytometry. The levels of IL6, IL12(p40) and TNFα were detected by ELISA and T cell proliferation was detected by 3HTdR incorportation test. RESULTS:  Treated with bifidobacteria DNA for 24 h, BMDC expressed a high level of Ia, CD40, CD86 and CD11c molecules, significantly increased the secretion of IL6, IL12 (p40) and TNFα and significantly enhanced the pro
liferation of allogenic and homogenic T cells. CONCLUSION:  Bifidobacteria DNA has remarkable stimulatory effects on BMDC maturation and antigenpresenting function.

　　【Keywords】 bifidobacteria DNA; dendritic cells; mice

　　【摘要】 目的： 探讨双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)成熟的影响. 方法： 纯化提取双歧杆菌DNA，并鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度；FACS检测BMDC的吞噬功能和表面标志分子，ELISA法检测BMDC分泌细胞因子水平，3HTdR掺入法检测T淋巴细胞增殖能力. 结果： 双歧杆菌DNA诱导24 h后BMDC高表达Ia, CD40, CD86和CD11c分子，明显增加IL6, IL12(p40), TNFα的分泌，显著增强同种异体和自体T细胞增殖的能力. 结论： 双歧杆菌DNA能够促进BMDC成熟，增强BMDC的抗原提呈能力.
 
　　【关键词】 双歧杆菌DNA；树突细胞；小鼠

　　0引言

　　树突状细胞(dendritic cells, DC)是机体功能最强的专职抗原提呈细胞，它能高效摄取、加工处理和提呈抗原，有较强的迁移能力，并能显著地激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节［1-2］. DC是否成熟对其功能的发挥十分重要. 近年来研究表明, 细菌脂多糖（LPS）具有明确的诱导DC成熟并影响其功能的作用［3］，由此设想同样来自细菌含有CpG的DNA很可能对DC分化发育和功能有一定的影响. 我们利用我室提取的双歧杆菌基因组DNA (bifidobacteria DNA, B DNA)，观察了其对小鼠骨髓树突状细胞(bone marrowderived dendritic cell, BMDC)成熟的影响.

　　1材料和方法
 
　　1.1材料

　小鼠重组GMCSF, IL4购自Promega 公司，LPS, 小牛胸腺DNA (Calf thymus DNA,CT DNA), DextranFITC购自Sigma公司，溶菌酶、限制性内切酶HpaⅡ购自医学院友谊公司，小鼠IL6, IL12(p40), TNFαELISA检测试剂盒购自R＆D公司，RPMI 1640完全培养基RPMI 1640（Hyclone公司）, 100 mL/L胎牛血清（Hyclone公司）组成，4℃保存备用；3HTdR购自Amersham公司，抗小鼠CD4(Gk1.5), CD8（2.43）, B220（RA3.3A1/6.1）, Iab(B212)单克隆抗体杂交瘤细胞株均购自ATCC，不同荧光素标记的大鼠抗小鼠单抗CD11cPE, CD40FITC, CD86PE, IabFITC及FITC或 PE标记的同型对照抗体均购自PharMingen公司，4℃保存. C57BL/6（H2Kb）小鼠60只，Balb/c（H2Kd）小鼠24只，6～8 wk，体质量18～20 g,雌性，上海必凯实验动物有限公司提供. 双歧杆菌菌株引自山东省卫生防疫站并通过细菌鉴定.

　　1.2方法

　　1.2.1B DNA的制备与鉴定［4］将双歧杆菌接种于硫乙醇酸盐肉汤中，置厌氧培养箱37℃培养72 h，收集细菌，加入溶菌酶(1 g/L)与100 g/L SDS(终浓度为10 g/L)裂解菌体；饱和酚抽提去除菌体蛋白，透析，用紫外分光光度计测定所提取的B DNA A260 nm/A280 nm为1.823，测定DNA浓度后经薄板层析证实所制备的B DNA中无LPS存在. B DNA与HpaⅡ酶作用后电泳结果显示，细菌DNA可被顺利切割成小片段，表明所制备的B DNA具有一定的非甲基化CpG基序，冷冻干燥后备用.

　　1.2.2小鼠BMDC的培养扩增［5］颈椎脱位法处死C57BL/c小鼠，无菌取股骨，冲洗出骨髓细胞，加TrisNH4Cl裂解液室温作用3 min，溶除红细胞，Hanks液洗2次，加入大鼠抗CD4, CD8, Iab, B220单抗混合液，抗体终浓度均为10 mg/L, 4℃孵育45 min, Hanks液洗1次，加入含20 g/L BSA的RPMI 1640培养基及Hepes 25 mmol/L沉悬细胞，再加入兔低毒性补体（10∶1稀释），37℃水浴45 min溶除T, B及Ia+细胞，Hanks洗2次，以1×106细胞/孔加入24孔板培养，加mGMCSF 10 μg/L, mIL4 1 μg/L，培养3 d后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入含有mGMCSF, mIL4的新鲜RPMI1640完全培养基，继续培养2 d 后，吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，收集后BMDC以1×106细胞/孔加入24孔板培养，分别加入B DNA (10 mg/L), LPS(1 mg/L), CT DNA (10 mg/L), PBS置37℃, 50 mL/L CO2培养24 h后，收集BMDC和培养上清待测.

　　1.2.3流式细胞仪检测BMDC表面标志和内吞能力收集培养各处理组BMDC，用PBS悬浮为1×109细胞/L，加入离心管，100 μL/管，分别加入荧光标记抗体Ia, CD40, CD86, CD11c，终浓度为5 mg/L，置4℃标记45 min，PBS洗2遍，以荧光标记的同型Ig作为对照；用流式细胞仪（FACS calibur，BD公司）CellQuest软件检测和分析BMDC表面标志. 收集培养各处理组BMDC，铺24孔培养板（2.5×105细胞/孔/500 μL）,然后加入预冷DextranFITC ，终浓度为25 mg/L，置37℃, 50 mL/L CO2孵育30 min，对照细胞加入DextranFITC后仍置于冰上孵育30 min. 预冷PBS洗细胞2次后，以流式细胞仪检测BMDC的荧光程度. FITC的绿色荧光的平均荧光强度（Geo mean）代表DC吞入胞内的DextranFITC的含量，从而反映DC对外来抗原的内吞能力.
 
　　1.2.4ELISA法检测BNDC分泌细胞因子的水平收集培养各处理组BMDC培养上清，采用ELISA法，按试剂盒说明书，在酶标仪上读取不同浓度的标准品相应的A450 nm值，绘制标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出IL6,  IL12 (p40 )和TNFα直线回归方程分别为： Y=0.0007X+0.0589,  Y=0.0019X+0.0891,  Y=0.0008X+0.1069. 将测得的不同培养上清的A值代入相应的直线回归方程中，得到相应的细胞因子的含量.

　　1.2.5混合淋巴细胞反应采用的3HTdR掺入法检测BMDC刺激同种异体或自体T细胞增殖反应的能力［5］. 取正常Balb/c小鼠或C57BL/6小鼠脾脏，制备无菌的脾细胞悬液，以RPMI 1640完全培养基悬浮，注入尼龙毛柱，置37℃, 50 mL/L CO2孵箱培养1 h，冲出非黏附的细胞即为纯化的T细胞，调节其密度至2×109/L，加入96孔圆底培养板，100 μL/孔；收集培养各处理组BMDC分别以30 Gy γ放射线灭活后，以2×104  (1∶10) /(孔・μL)分别加入到已含有反应细胞的各孔中，总体积200 μL，每组3个复孔. 置37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养96 h，于培养结束前16 h加入3HTdR（18.5 kBq/孔）. 收集细胞,液闪计数仪检测Bq值，结果以三个孔的平均值表示.
 
　　采用PEMS 3.0统计软件分析数据，数据用x±s表示，根据资料性质及特征应用方差分析，各组均数两两比较用SNKq检验.

　　2结果

　　2.1双歧杆菌DNA对BMDC表面分子表达的影响B DNA组BMDC表达Ia 分子, CD40分子, CD86分子和CD11c分子的平均荧光强度(Geo Mean)明显高于PBS对照组(表1)，提示B DNA诱导BMDC表达成熟DC表面分子.表1小鼠BMDC表面分子表达的平均荧光强度(略)

　　2.2B DNA对BMDC摄取抗原能力的影响FACS检测PBS, B DNA, LPS和CT DNA处理的BMDC摄取FITCDextran平均荧光强度(Geo Mean)分别为814±78, 356±32, 312±36和793±82 (n=3)，B DNA诱导的BMDC摄取DextranFITC能力与PBS处理的BMDC相比平均荧光强度明显降低［（814±78） vs  (356±32), q=12.9, P<0.01］. 提示B DNA诱导BMDC进入成熟状态，从而减弱了其摄取抗原的能力.
 2.3B DNA对BMDC产生细胞因子的影响B DNA诱导的BMDC分泌IL6, IL12(p40)和TNFα水平明显高于PBS对照组（表2），提示B DNA诱导BMDC合成和分泌多种细胞因子.表2  BMDC培养上清中细胞因子含量的检测(略)

　　2.4B DNA对BMDC诱导同种异体T淋巴细胞增殖能力的影响在BMDC与T淋巴细胞比例为1∶10时，PBS, B DNA, LPS和CT DNA处理的BMDC激活同种异体T细胞增殖的能力(3H/Bq)分别为25±3, 104±9,  125±9, 41±5 (n=3). B DNA诱导的BMDC与PBS对照组的BMDC比较，具有强烈的激活同种异体T细胞增殖的能力，差异均有统计学意义［（104±9） vs  (25±3), q=19.4, P<0.01］，表明B DNA和LPS诱导的BMDC具有强烈的抗原提呈功能.
 
　　2.5B DNA对BMDC诱导自体T淋巴细胞增殖能力的影响当BMDC与T淋巴细胞比例为1∶10时，PBS, B DNA, LPS和CT DNA处理的BMDC激活自体T细胞增殖的能力(3H/Bq)分别为50±6, 142±10, 126±9, 58±5 (n=3). B DNA诱导的BMDC与PBS对照组的BMDC比较，具有强烈的激活同种自体T细胞增殖的能力，差异均有统计学意义［（142±10） vs  (50±6), q=21.0, P<0.01］，表明B DNA可增强BMDC的抗原提呈能力.

　　3讨论

　双歧杆菌为肠道正常菌群菌，对维持肠道的微生态平衡起重要作用，是维持人体健康的关键成分之一. 双歧杆菌的细胞壁成分能有效地激活免疫细胞，促使这些效应细胞释放免疫活性物质，并对多种肿瘤的发生与具有一定抑制作用.  小鼠J774A.1巨噬细胞具有区分B DNA和哺乳动物DNA的能力［4］，哺乳动物的DNA中的碱基甲基化程度高，则对机体免疫系统无激活作用. Pisetsky等［6］报道，哺乳动物DNA具有抑制免疫特性，它能够中和细菌DNA的诱导巨噬细胞产生IL12作用.

　　DC是目前已知的机体内功能最强的、惟一能够活化处女型T细胞的APC，因此是免疫应答的启动者. 机体内存在多种机制，通过调节DC的功能，以调控免疫应答和维持自身耐受. 目前认为，DC在调控免疫应答过程中的机制有［1,7-8］：① 不同分化发育阶段的DC，介导性质截然不同的免疫应答. 高表达Ⅱ类主要组织相容性抗原（MHCⅡ）分子和共刺激分子的充分活化的DC能够刺激T细胞活化，因而启动T细胞介导的免疫应答；而中度表达MHCⅡ和共刺激分子、保存抗原摄取和加工潜能、处于成熟但非活化状态的DC可能介导耐受型T细胞分化，参与维持机体的自身耐受. ② 不同亚群的DC能够识别不同性质的抗原，诱导不同性质的辅助性T细胞(Th细胞)活化. 髓系来源的DC主要介导Th1型细胞分化；淋巴系来源的浆细胞样DC主要诱导Th2细胞分化，但在病毒感染的情况下，通过分泌大量的Ⅰ型干扰素诱导Th1细胞活化. Th2细胞介导的免疫应答能够抑制Th1型细胞介导的免疫应答，反之亦然. ③ DC诱导调节性T细胞(regulatory T cell, Tr)分化，Tr细胞抑制效应T细胞介导的免疫应答. ④ 成熟活化DC的适时凋亡. 抗原提呈能力是DC主要功能，未成熟DC摄取抗原的能力较强，在抗原和细胞因子等刺激下，DC逐渐成熟并迁移到外周免疫器官，丧失了摄取抗原的能力，发挥抗原提呈作用，激活T细胞启动免疫应答. 本实验发现BMDC接受双歧杆菌DNA刺激后，内吞功能明显降低. B DNA能增强BMDC分泌IL6, TNFα和IL12(p40) 水平，表明B DNA能够促进BMDC成熟，摄取抗原的能力降低，从而发挥抗原提呈作用.

　　同种异体或自体混合淋巴细胞反应主要是由于刺激细胞中抗原提呈细胞上表达的MHCII及共刺激分子能直接刺激T细胞的增殖，T细胞反应的强弱与共刺激分子的丰度关系很大，共刺激分子表达越高，其对淋巴细胞的刺激能力越强. 成熟DC由于其表达高丰度的MHCII和多种共刺激分子，因此其对淋巴细胞具有很强的刺激能力，而未成熟DC的刺激能力则较弱. 因此混合淋巴细胞反应能在一定程度上反应刺激细胞的抗原提呈能力. 本实验发现B DNA诱导的BMDC高表达Ia, CD40, CD86和CD11c分子，同时具有强烈的激活同种异体T细胞和自体T细胞增殖的能力，表明双歧杆菌DNA可增强BMDC的抗原提呈能力.

　　本研究发现B DNA与LPS在效应方面具有一定的相似性，它们都能够促进BMDC成熟，表达高丰度的MHCII和多种共刺激分子，使其合成和分泌多种细胞因子，增强BMDC的抗原提呈能力. 本结果提示B DNA可作DC的激活剂，为微生物DNA制剂开发应用提供依据.

　　致谢： 泰山医学院预防医学教研室程琮教授对本文统计学处理的指导

　　【】

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