白藜芦醇对小鼠永久性局灶脑缺血损伤后血脑屏障的影响
【关键词】 白藜芦醇
Influence of resveratrol on damage of blood brain barrier in permanent focal cerebral ischemic injury in mice
【Abstract】 AIM: To discuss the influence of resveratrol on the damage of blood brain barrier (BBB) in permanent focal cerebral ischemic injury in mice. METHODS: Ischemia was induced by intraluminal permanent middle cerebral artery occlusion（MCAO）and Evans blue was injected. The extent and quantity of Evans blue extravasation were measured and the expression of MMP9 was shown by RTPCR. RESULTS: Resveratrol significantly diminished the extent and quantity of Evans blue extravasation ［（101±15）mm3 vs （149±17） mm3, (8.6±2.9)% vs (18.6±3.8)%, P<0.01］ and inhibited the expression of MMP9 ［(0.693±0.008) vs (1.537±0.037), P<0.01］. CONCLUSION: Resveratrol, due to its neuroprotective effect, can inhibit the activity of MMP9 and alleviate the disruption of BBB.
【Keywords】 brain ischemia; resveratrol; gelatinase B; blood brain barrier
【摘要】 目的： 探讨白藜芦醇对小鼠永久性局灶脑缺血后血脑屏障损伤的影响. 方法： 采用线段血管内栓塞大脑中动脉(MCAO)获得小鼠脑缺血模型,静脉注射Evans blue，观察白藜芦醇对缺血24 h后脑组织中Evans blue外渗范围和含量的影响，同时应用RTPCR技术检测缺血脑组织中基质金属蛋白酶9（MMP9）的mRNA水平. 结果： 白藜芦醇减轻了Evans blue外渗范围［（101±15） mm3 vs （149±17）mm3, P<0.01］和含量［(8.6±2.9)% vs (18.6±3.8)%, P<0.01］，并能够抑制MMP9的表达［(0.693±0.008) vs (1.537±0.037), P<0.01］. 结论： 白藜芦醇可以抑制MMP9活性，减轻血脑屏障的损害，其神经保护作用与此有关.
【关键词】 脑缺血；白藜芦醇；明胶酶B；血脑屏障
0引言
白藜芦醇（Resveratrol）是一类主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物,具有抗氧化、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗肿瘤等生物学活性［1，2］. 脑缺血损伤后，白藜芦醇可以通过对自由基、一氧化氮（NO）及炎性因子的调节发挥作用［3-5］；可以减小脑缺血后梗死灶体积,减轻缺血后的损伤反应［6］. 因此，白藜芦醇神经保护性作用的研究已经成为近年来神经领域里的一个热点. 我们观察了白藜芦醇对脑缺血性损伤后血脑屏障的影响，同时检测了白藜芦醇对基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP9)表达的调节.
1材料和方法
1.1材料
健康成年雄性昆明小鼠40只，体质量（20±2）g，由第四军医大学实验动物中心提供； Evans blue和白藜芦醇由美国Sigma公司提供.
1.2方法
1.2.1动物分组及模型制作昆明小鼠随机等分为Evans blue测量组和MMP9测量组，各组再等分为白藜芦醇组和单纯缺血对照组，每组10只. 白藜芦醇按30 mg/(kg・d)剂量强饲预治疗，共7 d. 小鼠经2 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉后（50 mg/kg），正中切开颈部皮肤，经颈总动脉插入80尼龙纤维线段永久栓塞大脑中动脉［7］. 栓塞成功后，经左侧股静脉注射Evans blue. 术后置于32℃保温箱中3 h,自由喂养.
1.2.2Evans blue外渗范围和含量的测定缺血后24 h，小鼠断头取脑，并切成2 mm厚的冠状脑片，机辅助图像分析系统下测定Evans blue外渗的面积，将各脑切片的外渗面积乘以2 mm再相加即为整个外渗区域的体积. 将脑片从中线分开，左右半球的脑片各置于1.5 mL离心管中. 加入1 mL 0.1 mol/L PBS，用次声匀浆器将脑组织制成匀浆，在1000 g下离心15 min；取0.7 mL三氯醋酸加入等量上清液中，4℃下共育18 h，离心30 min，取上清液1 mL，用分光光度仪在610 nm波长条件下，通过与标准Evans blue液的比较来测定脑组织中Evans blue的含量.
1.2.3MMP9的检测（RTPCR）① 提取总RNA： 将缺血24 h后的小鼠在深度麻醉下断头取脑，缺血侧半球装入1.5 mL离心管中，迅速冷凝，置于-88℃冰箱中保存备用. 按照ISOGENLS RNA快速提取试剂盒（日本富山基因公司）说明提取总RNA. ② 反转录合成cDNA： 依照SuperScriptTM反转录第一链合成试剂盒（美国Invitrogen公司）的说明进行. ③ 引物合成： MMP9的特异性引物由上海博亚生物工程公司合成，其寡核苷酸引物序列为: 5′CTGTATGGCTTCTGCCCTACCCGAGTGGAC3′. ④ RTPCR扩增： 在50 μL反应体积中加入0.2 μg合成的cDNA, 5 μL 10×的PCR缓冲液、5 μL 1 mmol/L MgSO4, 15 pmol的引物，16.67 nkat的KODPlusDNA聚合酶. 使用PTC100 PCR仪进行热循环. 取10 μL PCR产物，经30 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统进行检测,并与内参照GAPDH条带进行对比，计算各阳性条带的相对密度值.
统计学处理： 数据用x±s表示，采用SPSS10.0对两组之间进行t检验，P<0.05有统计学意义.
2结果
2.1Evans blue外渗与单纯缺血组比较，使用白藜芦醇后明显降低了Evans blue外渗的范围和程度（图1）. 统计学分析表明，白藜芦醇组的Evans blue外渗体积和含量均明显小于单纯缺血组［（101±15） mm3 vs （149±17） mm3, (8.6±2.9)% vs (18.6±3.8)%, P<0.01］.
图1白藜芦醇对脑缺血后Evans blue外渗的影响
2.2MMP9的表达结果RTPCR结果显示，与单纯缺血组比较，白藜芦醇明显抑制了MMP9在脑缺血24 h后的表达（图2），各条带的密度显示，白藜芦醇治疗组（0.693±0.008）明显小于单纯缺血组（1.537±0.037, P<0.01）.
3讨论
MMP9是一种锌依赖的蛋白水解酶，具有降解多种细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分的功能. 动物实验显示局部脑缺血后MMP9在早期就被激活［8］，并参与脑缺血引发的一系列病理生理改变. 血脑屏障由毛细血管内皮细胞、基底膜及附着于基底膜外层的星型胶质细胞足突等构成，在维持神经系统内环境的相对稳定方面有着重要的意义. 其中，基底膜主要由Ⅳ型胶原、层粘素、黏连蛋白等细胞外基质成分构成，而这些都是MMP9的作用底物. 脑缺血损伤后， MMP9表达增加，并作用于这些细胞外基质成分，破坏血脑屏障的正常结构和功能，引起神经系统内环境紊乱，促使神经元死亡.
Evans blue染色法显示脑卒中MMP9过度表达的同时，血脑屏障的渗透性明显增加，引起血管源性脑水肿. 而卒中后继发性脑水肿高峰期给予外源性MMP9抑制剂，可以明显减少注射区域远隔部位脑组织中水、钠含量，这提示MMP9抑制剂可能成为控制脑缺血损伤后继发性脑水肿的新方法.
我们通过检测Evans blue外渗的范围和含量，证实了白藜芦醇可以减轻脑缺血后血脑屏障的损害并抑制MMP9的活性. 白藜芦醇对MMP9的抑制作用的机制仍未完全清楚，在缺血性脑损伤的过程中， MMP9目前可知的合成刺激因子有早期基因cfos, cjun, 脂多糖（LPS）, 肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β以及其他的炎性介质等，而上述这些因子都会受到白藜芦醇的负性调节，白藜芦醇对MMP9表达的抑制可能与此有关. 基于以上实验结果，白藜芦醇可能作为潜在的MMP9抑制剂，通过抑制MMP9的活性，减轻血脑屏障的损伤来起到神经保护作用. 目前人工合成开发的MMP9抑制剂生物利用度较差、毒副作用较大，在脑卒中的治疗中应用有限, 而白藜芦醇作为一种天然植物抗毒素，无上述缺点，可以作为潜在的MMP9抑制剂，在临床治疗缺血性脑血管病中起到重要的意义.
【】
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