乳腺癌中STAT3对HSP27和c

【关键词】  乳腺癌

　　Regulating role of STAT3 to HSP27 and cMYC expression in breast cancer

　　【Abstract】 AIM: To investigate the regulating role of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) to 27 ku  heat shock protein (HSP27) and cMYC expression in breast cancer. METHODS:  Expressions of STAT3, HSP27 and cMYC were examined in primary breast infiltrating duct carcinoma tissues of 51 patients using immunohistochemistry. Correlations between STAT3 expression and HSP27 or cMYC expression were analyzed with statistic method. After the transfection of MDAMB435S human breast carcinoma cells with STAT3 decoy oligodeoxynucleotides (Decoy ODNs), expressions of HSP27 and cMYC of MDAMB435S were  semiquantified by Western blot, the apoptosis and the cell cycle distribution of MDAMB435S cells were analyzed with flow cytometry and proliferation of MDAMB435S cells was analyzed by MTT assay. RESULTS:  In primary breast infiltrating duct carcinoma tissues, STAT3 expression was correlated positively with HSP27 expression and cMYC expression respectively (rs=0.454, P=0.001; rs=0.541,  P=0.000). As the result of STAT3 inhibition by STAT3 Decoy ODNs in MDAMB435S cells, expressions of HSP27 and cMYC were markedly reduced, which was consistent with STAT3 activation reduction (Both P<0.01). The cell cycle progression of MDAMB435S cells was significantly inhibited at G0/G1 phase, the apoptosis of those cells was augmented and their proliferation was inhibited  (P<0.01). CONCLUSION:  Constitutively activated STAT3 may upregulate HSP27 and cMYC expression to inhibit breast cancer cell apoptosis and to facilitate their proliferation, thus leading to the malignancy of breast cancer cells.

　　【Keywords】 breast neoplasms; oncogenes; signal transducer and activator of transcription 3; heat shock  proteins 27; genes, cMYC

　　【摘要】 目的：研究人乳腺癌组织中信号转导和转录激活因子3(STAT3)对热休克蛋白27（HSP27）和cMYC的调控作用. 方法：应用免疫组化检测51例人乳腺癌组织STAT3，HSP27，cMYC蛋白的表达，分析他们的相互关系及与临床预后相关指标的关系. 在体外应用诱骗寡核苷酸（Decoy ODNs）抑制乳腺癌细胞MDAMB435S STAT3活性，Western blot检测MDAMB435S细胞HSP27，cMYC蛋白表达，MTT检测肿瘤细胞增殖力，FCM检测MDAMB435S细胞周期和凋亡.  结果：在人乳腺浸润性导管癌组织中，STAT3的表达与HSP27和cMYC表达均成正相关（rs=0.454,P=0.001；rs=0.541，P=0.000）. 使用Decoy ODNs抑制人乳腺癌细胞株MDAMB435S STAT3活性能使其HSP27和cMYC表达明显下调（P均<0.01），并使细胞阻滞于G0/G1期，凋亡增加，细胞增殖能力下降（P<0.01）. 结论：STAT3表达可能通过上调HSP27和cMYC的表达，抑制乳腺癌细胞的凋亡和促进其增殖，从而有利于乳腺癌进展并使其恶性程度增高.

　　【关键词】 乳腺肿瘤；癌基因；信号转导和转录激活因子3；热休克蛋白27；基因，cMYC

　　0引言

　　信号转导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)通过调节下游基因的表达在肿瘤细胞增殖和分化过程中起着重要作用，但到目前为止，对STAT3调节的靶基因所知甚少. 我们通过检测人乳腺癌标本中STAT3，热休克蛋白27（heat shock  protein 27 ku, HSP27），cMYC蛋白的表达和通过诱骗寡核苷酸(decoy oligodeoxynucleotides, Decoy ODNs)抑制人乳腺癌细胞株MDAMB435S STAT3活性，检测其HSP27，cMYC蛋白表达，探讨在乳腺癌中，STAT3的过度激活对HSP27和cMYC的表达的调节作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　组织标本为重庆医科大学第一200110/200202经病诊断为女性乳腺浸润性导管癌标本51例，年龄34~61岁，术前未经化疗. 乳腺癌细胞株MDAMB435S（重庆医科大学第一医院器官移植研究室保存），RPMI 1640（Hyclone公司），新生小牛血清（杭州四季青公司）. 阳离子脂质体转染试剂lipofenctin（Invitrogen公司）. Decoy ODNs为能够特异地与磷酸化的STAT3和STAT1形成的同源或异源二聚体结合的sis诱导因子(SIF)复合物结合的M67基序，sense序列为5′TGCATTTCCCGTAAATCT3′， antisense序列为 5′AAGATTTACGGGAAATGC3′，全部经过硫代修饰，Mismatch Decoy ODNs(MDecoy ODNs) 为Decoy ODNs下划线部分碱基重排，FITCDecoy ODNs的sense 和antisense序列同Decoy ODNs，sense链5′端标记FITC，由上海Sangon合成. 兔抗鼠STAT3多抗，兔抗鼠HSP27多抗，兔抗鼠βactin多抗，HR标记的羊抗兔Ig多抗（Santa cruz公司）. T7核苷酸激酶（Promega公司），Poly(dIdC)・Poly(dIdC)（Amersham公司），γ32PATP（北京福瑞公司），Western blot增强放光试剂（北京中山公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1免疫组化采用SP法，组织切片经微波修复抗原后，按试剂盒说明操作. 一抗为羊抗大鼠STAT3多抗、羊抗大鼠cMYC多抗和羊抗大鼠HSP27多抗，二抗为HR标记的兔抗羊Ig，DAB显色. 随机计数5个视野，阳性细胞数多于10%判断为阳性.

　　1.2.2凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)收集MDAMB435S细胞5×106，加缓冲液A ［10 mmol/L HepesNaOH (pH 7.8)，15 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，1 mg/L leupeptin］ l00 μL混悬，冰上肿胀15 min. 再加100 g/L NP40 10 μL涡动10 s，10 000 g离心30 s(室温)；弃上清，沉淀加缓冲液B ［20 mmol/L HepesNaOH (pH 7.9)，1.5 mmol/L MgCl2，0.42 mmol/L NaCl，0.2 mmol/L  EDTA, 250 mL/L甘油，0.5 mmol/L  DTT，0.5 mmol/L  PMSF，1 mg/L Leupeptin］ 50 μL，混悬，冰浴30 min，4℃ 12 000 g离心4 min，吸取上清，即为核蛋白. Decoy ODNs 和MDecoy ODNs分别用T4多聚核苷酸激酶掺入γ32PATP标记后，再结合成双链探针，乙醇沉淀法纯化探针，调整浓度为1 mg/L. 探针与核蛋白的结合反应体系为DNA结合缓冲液16 μL ［1 mmol/L  TrisHCl (pH 8.0) 10 μL, 1 mmol/L  NaCl 50 μL，0.5 mmol/L EDTA (pH 8.0) 1 μL, 1 mmol/L DTT 1 μL，1 mmol/L MgCl2 1 μL，甘油40 μL, Poly(dIdC)(1 g/L) 25 μL，无核酶双蒸水872 μL］；细胞核蛋白3 μg；标记Decoy ODNs或MDecoy ODNs 1 μL(1 ng). 37℃反应30 min，上样于80 g/L聚丙烯酰凝胶，电泳、干胶、放射自显影. Supershift EMSA是预先将核蛋白与兔抗大鼠STAT3抗体0.5 μg 室温下孵育20 min.

　　1.2.3细胞培养和转染MDAMB435S细胞培养于含100 mL/L新生小牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃，50 mL/L CO2浓度，饱和湿度的恒温孵箱中培养. FITCDecoy ODNs转染参照lipofenctin试剂说明书，MDAMB435S细胞每孔5×104培养于12孔板中的无菌盖波片上，用4 μmol/L的FITCDecoy ODNs和4 mL/L的lipofenctin转染细胞，24和48 h后取出盖玻片，中性甲醛固定，封片后荧光显微镜下观察，每片随机计数5个视野，计数带绿色荧光的细胞数在总细胞数中的比例，转染率. Decoy ODNs和MDecoy ODNs分别转染MDAMB435S细胞，转染浓度同前，并设空白对照组，只转染lipofenctin试剂，每实验组设3样本，细胞数为5×105.

　　1.2.4Western blot收集转染48 h后的MBAMD435每组5×105，用去污剂裂解缓冲液［50 mmol/L TrisHCl (pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，1 g/L SDS，100 mg/L PMSF，1 mg/L Aprotinin，10 g/L NP40］裂解细胞，提取总蛋白. 紫外吸收法进行蛋白定量 . 调整浓度至4 g/L，取25 μL总蛋白，80 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜，按蛋白质分子质量Marker将PVDF膜剪开，按次序分别用一抗(兔抗鼠HPS27，兔抗鼠cMYC，兔抗鼠βactin)和二抗(羊抗兔IgGHRP)孵育膜. 最后使膜与Western blot发光试剂作用，X线胶片曝光，显影、定影，扫描入机，用SigmaGel软件分析相对积分光密度.

　　1.2.5MTT法细胞转染48 h后，每孔加入MTT 10 μL，混合后培养4~6 h，离心，吸弃上清，每孔加入DMSO 100 μL，稍振荡让甲肷产物充分溶解，酶标仪测A560 nm.

　　1.2.6流式细胞术转染48 h后，收集细胞每组5×105，4℃预冷750 mL/L乙醇固定，洗涤，加适量的含RNA酶的碘化丙啶（PI）染色液反应30 min，流式细胞仪检测.
 
　　统计学处理: 用SPSS 11.5统计软件包，计数资料采用χ2检验，相关系数用rs表示；计量资料数据用x±s表示，组间比较用OneWay ANOVA分析. P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　2.1乳腺癌中STAT3蛋白表达与HSP27，cMYC蛋白表达之间的关系STAT3的表达与HSP27表达正相关(rs=0.454，P=0.001)；STAT3的表达与cMYC表达成正相关(rs=0.541，P=0.000,表1）. STAT3，HSP27，cMYC在乳腺癌组织中表达(图1).表1乳腺浸润性导管癌组织中STAT3表达与HSP27，cMYC表达之间的关系（略）

　　2.2FITCDecoy ODNs的转染MDAMB435S细胞的效率用荧光显微镜观察到转染后48 h，FITCDecoy ODNs大部分位于细胞核内. 计算得出转染效率为(85.6±3.2)%. 图2示代表性图片.

　　2.3Decoy ODNs与激活的STAT3蛋白的特异性结合及Decoy ODNs对MDAMB435细胞HSP27和cMYC蛋白表达的影响EMSA证实了γ32PDecoy ODNs能与MDAMB435S细胞核蛋白中的激活的STAT3蛋白结合，在凝胶电泳时出现一条滞后带，Supershift试验证实滞后带为结合了γ32PDecoy ODNs的STAT3蛋白(图3). Decoy ODNs的转染MBAMD435细胞48 h， MBAMD435细胞HSP27蛋白表达显著下降，与对照组和MDecoy ODNs组比较有统计学意义(P<0.01, 图4). A: STAT3; B: HSP27; C: cMYC.
图1STAT3, HSP27及cMYC在乳腺浸润性导管癌组织中的免疫组化阳性染色×400
荧光指示细胞内FITCDecoy ODN.  A，B：转染前；C，D：转染后24 h；E，F：转染后48 h.

　　2.4Decoy ODNs对MBAMD435细胞凋亡、细胞周期及细胞增殖的影响Decoy ODNs的转染MDAMB435S细胞后48 h，FCM监测到出现亚二倍体峰（20.63%），MDecoy ODNs组与对照组相似，未见亚二倍体峰（图5A,B,C）. Decoy ODNs转染MDAMB435S细胞后48 h，G0/G1期细胞比例增加，与MDecoy ODNs组和对照组比较均有显著差异(P均<0.01, 图5D). 转染Decoy ODNs后24， 36及48 h，MDAMB435S细胞的增殖明显受到抑制，分别与MDecoy ODNs组和对照组比较均有统计学意义(P均<0.01，表4). 表4MTT法分析转染后MDAMB435S细胞的增值（略）

　　3讨论

　　STAT3被认为是一种癌基因［1］，在多种乳腺癌细胞、试验性动物肿瘤模型和人乳腺癌组织标本中存在STAT3的过度激活［2］. 被细胞因子和生长因子等上游调节因素激活后，STAT3蛋白705位的酪氨酸残基发生磷酸化，然后形成同源二聚体转位到核内，与其所调节基因的启动子序列相结合，调节相关基因的表达，从而刺激肿瘤细胞增殖，促进肿瘤血管生成，抵抗化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡［3］. 但是目前对调节的下游基因所知甚少. 我们通过免疫组化检测51例乳腺癌标本中STAT3，HSP27，cMYC蛋白的表达发现， STAT3的表达与HSP27及cMYC表达均成正相关. 在体外实验中我们检测到MDAMB435S细胞具有很高的STAT3活性，与报道MDAMB435S细胞STAT3过度激活相符［4］. 本实验采用能与STAT3特异性地结合的M67序列作为Decoy ODNs，首先通过EMSA证实了其在体外能特异性地与激活的STAT3结合，并通过荧光显微镜证实能被高效转染乳腺癌细胞MDAMB435S. 然后通过Decoy ODNs抑制MDAMB435S的STAT3活性，检测到HSP27，cMYC的表达被明显下调，并使其细胞周期被阻滞于G0/G1期，细胞增殖下降、凋亡增加.

　　HSP27是HSP家族中的成员之一，参与细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导调节等. HSP27可能通过抑制细胞色素C释放及抑制caspase3活性等多种途径抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，在乳腺癌患者体内HSP27过度表达可使发病间期缩短，是恶性乳腺癌预后不良标志，与肿瘤的浸润程度有关［5］.

　　HSP27蛋白在乳腺癌中的高表达可影响肿瘤细胞对激素的敏感性，用HSP27抗体治疗，可使乳腺癌患者的生存率提高［6］. HSP27还与肿瘤多药耐药有关［7］. 本研究表明，在乳腺癌中，STAT3可能通过调控HSP27的表达而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，使其恶性程度增加并影响肿瘤细胞对激素治疗的敏感性.

　　cMYC原癌基因蛋白在细胞周期的G1期调控中有着重要作用，当细胞受到有丝分裂原等各种信号的刺激后，细胞由G0期进入G1期，cMYC的表达水平迅速升高，cMYC蛋白具有DNA结合活性，调节其他相关基因的表达，调控细胞的生长、分化［8］. cMYC蛋白在乳癌细胞中过度表达，可作为癌细胞快速增长、乳腺癌进展及侵袭性强的客观指标［9］. 我们通过Decoy ODNs抑制乳腺癌细胞MDAMB435S的STAT3活性后，cMYC的表达被明显下调，肿瘤细胞被阻滞于G0/G1期，增殖下降和出现显著的凋亡峰. 说明在乳腺癌中，STAT3可能通过调控cMYC的表达而抑制细胞凋亡，使乳腺癌细胞进入细胞周期，不断增殖而快速增长，使其恶性程度增加.

　　综上所述，在乳腺癌中，STAT3的过度激活可能通过上调HSP27和cMYC的表达促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导肿瘤细胞对化疗的抵抗，从而促进乳腺癌的发生、.

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