代谢型谷氨酸受体亚型在成年猕猴腰骶段脊髓中的分布
【关键词】 脊髓
Distribution of subtypes of metabotropic glutamate receptors in lumbosacral spinal cord of adult macaques
【Abstract】 AIM: To explore morphological evidence for the possible roles of metabotropic glutamate receptors in the lumbosacral spinal cord in adult macaques. METHODS: The distribution patterns of metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in the lumbosacral spinal cord were studied by employing the immunohistochemical technique. RESULTS: MGluR1α distributed throughout all the laminae of spinal cord. The immunoreactive (ir) products were located on the soma or protrudes of a few interneurons together with the neuropil in the superficial layers of the spinal dorsal horn. In the deeper layers of spinal dorsal horn, intermediate nucleus and the ventral horn, mGluR1αir neurons were observed. The neurons in the ventral horn showed the strongest immunoreactivity. mGluR5ir products, similar with those of mGluR1α, also distributed in neuropil and the soma together with protrudes of some interneurons in the superficial layers of the spinal dorsal horn. In other areas of spinal cord, however, abundant mGluR5ir neuronal soma and protrudes were also observed. MGluR2/3 and mGluR7 distributed in the neuropil of the superficial layers in spinal dorsal horn. No neurons showed mGluR2/3/mGluR7immunoreactivity. CONCLUSION: MGluRs may play some important modulatory roles in the transmission or integration of information in the spinal local circuits of the adult mammals.
【Keywords】 receptors，metabotropic glutamate;spinal cord;macaca mulatta; immunohistochemistry
【摘要】 目的： 为探讨代谢型谷氨酸受体亚型在猕猴脊髓中可能的功能提供形态学依据.方法： 采用免疫组织化学技术, 在光学显微镜下观察代谢型谷氨酸受体亚型(mGluR1α, 2/3, 5, 7) 在大鼠腰骶段脊髓内的分布.结果： mGluR1α在脊髓全层中均有分布.在后角浅层中，免疫染色阳性产物主要见于神经毡和少量中间神经元的胞体及突起.在后角深层、中间带外侧核以及脊髓前角中则分布有较多数量的免疫染色阳性的神经元胞体和突起，其中前角运动神经元呈免疫染色强阳性；mGluR5样免疫染色阳性结构在后角浅层中也主要分布于神经毡和中间神经元的胞体及突起，而在脊髓的其他区域则分布有大量的免疫染色强阳性神经元及突起；mGluR2/3和mGluR7亚型主要分布在脊髓后角浅层神经毡，未见免疫染色阳性神经元.结论： 代谢型谷氨酸受体可能对成年哺乳动物脊髓局部环路的信息传递与整合发挥调节作用.
【关键词】 受体，亲代谢性谷氨酸盐；脊髓；猕猴；免疫组织化学
0引言
谷氨酸(Glutamate, Glu) 是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质, 与兴奋性突触传递、神经元的发育和死亡、突触的可塑性以及某些神经疾病的发生密切相关.长期以来，人们一直认为谷氨酸仅通过一类配体门控性离子通道受体（即NMDA、AMPA和KA受体）来发挥对突触传递的快速性调节作用.然而，近年的实验表明, 谷氨酸还可通过一类G蛋白偶联受体，即代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)，参与离子通道的调节和第二信使的合成.应用分子生物学技术迄今已成功地克隆出8种亚型代谢型谷氨酸受体 (mGluR18) ［1-4］.根据各亚型间氨基酸序列的同源性、信号转导机制以及药特性, 又可将之归类为3组: ① mGluR1和mGluR5;② mGluR2和mGluR3;③ mGluR4,mGluR6，mGluR7和mGluR8.
脊髓是哺乳动物躯体和内脏感觉和运动的低级中枢.脊髓后角是机体接受伤害性信息传入的重要部位，也是对伤害性信息进行加工、整合处理的初级门户.脊髓前角富集运动性神经元，同时也是下行性传导束发挥运动调节作用的最终靶区.大量的研究表明： 大鼠脊髓中含有丰富的代谢型谷氨酸受体［5-10］，它们在脊髓水平的信息传递与整合过程中发挥重要的作用.然而，代谢型谷氨酸受体各个亚型在灵长类动物脊髓中的分布情况，目前则鲜见报道.因此, 本研究采用免疫组织化学方法系统地观察了代谢型谷氨酸受体各个亚型在成年猕猴腰骶段脊髓中的分布情况.
1材料和方法
11材料成年雄性猕猴2只，体质量8～10 kg.均购自第四军医大学实验动物中心.846合剂 im将其深麻后, 开胸经升主动脉插管.随后用1500 mL的磷酸盐缓冲液(001 mol/L PBS, pH 74) 冲血, 再用8 L含40 g/L多聚甲醛和10 g/L苦味酸的磷酸缓冲液(PB, pH 74) 灌注固定2 h.灌注毕后取出腰骶段脊髓，剥膜并修块后将之置于含300 g/L蔗糖的01 mol/L的PB（pH 74）内过夜直至沉底(4℃).
12方法
121免疫组织化学方法取出脊髓行冰冻切片，片厚30 μm.切片分为7套, 充分漂洗后收集于001 mol/L PBS内.第1～4套切片分别行mGluR1、mGluR2/3、mGluR5和mGluR7免疫组织化学染色.具体步骤如下：① 兔抗mGluR1、mGluR2/3、mGluR5和mGluR7抗体室温孵育过夜, 稀释度分别为1∶1000, 1∶500, 1∶1000, 1∶500.抗体特异性均已鉴定［1-4］；② 生物素标记的羊抗兔IgG (Sigma, 1∶400)室温孵育2 h；③ ABC复合物(Sigma, 1∶400)室温孵育2 h.切片最后在含有05 g/L DAB (Sigma)和003 g/L H2O2的005 mol/L TrisHCl缓冲液(pH 76)内呈色20～30 min.以上各步骤间均用001 mol/L PBS充分漂洗.呈色结束后裱片、脱水透明、DPX 封片.第5套切片行Nissl染色.
122第6、7套切片分别用正常兔血清和001 mol/L PBS替代一抗, 再按上述步骤进行免疫染色，结果均为阴性.
2结果
MGluR1α在脊髓各层中均有分布.在脊髓后角和中间带外侧核中主要见于神经毡，但是也可见到少量免疫染色阳性的神经元稀疏地分布在脊髓灰质中，胞体多为椭圆形或梭形，由背侧向腹侧方向伸展（Fig 1A）.免疫阳性产物及其分布密度均呈由脊髓后角向中间带外侧核逐渐递减的趋势.但是在脊髓前角中则分布由浓密的免疫染色强阳性的神经元（Fig 1B）；mGluR5也分布于脊髓全层.但是免疫染色强度和免疫染色阳性结构的密度均明显高于mGluR1α.在脊髓后角浅层，免疫阳性产物主要分布在神经毡中，但也有少量的免疫染色阳性的神经元胞体（Fig 1C）.在后角深层和中间带外侧核中，免疫阳性产物主要分布在神经元的胞体及树突上，胞体多为椭圆形、梭形或多角形（Fig 1C, D）.脊髓前角中则密集分布有大量的免疫染色强阳性的运动神经元的胞体和树突（Fig 1E, F）;与I组代谢型谷氨酸受体的分布截然不同的是，mGluR2/3和mGluR7仅仅分布于脊髓后角浅层神经毡中，没有观察到免疫染色阳性的神经元胞体（Fig 1G, H）.在脊髓后角深层和前角中则没有发现mGluR2/3和mGluR7的免疫染色阳性结构.
3讨论
在本研究中，我们观察到I组代谢型谷氨酸受体（mGluR1α和mGluR5）在成年猕猴脊髓全层中均有表达.其中，mGluR1α在脊髓前角神经元中表达强度较高，这一现象与mGluR1α在大鼠脊髓中的分布情况相类似但又有所不同.大鼠脊髓中，mGluR1α主要分布在后角深层和前角［7］.而Aronica等［11］则报道在正常人脊髓中，mGluR1α也分布于脊髓全层中.在大鼠脊髓中，mGluR5主要分布在后角浅层.超微研究结果表明它们主要分布在脊髓后角中间神经元的胞体和树突上［5-7］.本研究结果也表明，在猕猴脊髓后角中有大量的mGluR5免疫染色强阳性的中间神经元，提示它们可能主要定位在突触后膜.此外，除脊髓后角外，脊髓前角运动神经元也强烈地表达mGluR5，表明mGluR5不仅参与了初级传入信息在猕猴脊髓后角中的传递与整合，而且也可能对前角运动神经元的功能发挥调节作用.
与Ⅰ组代谢型谷氨酸受体相比，Ⅱ组代谢型谷氨酸受体在猴脊髓中仅仅分布于后角浅层.这一结果与在大鼠中的研究结果十分相似.免疫组化和原位杂交结果均未能在大鼠脊髓中检测到mGluR2或其mRNA的存在.Baxall等［8］报道mGluR3在大鼠脊髓中主要分布在后角，而且在紫外线辐射造成外周炎症时，后角Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ层中mGluR3的mRNA发生了上调.尽管有关于Ⅱ组代谢型谷氨酸受体位于突触后的报道，但是绝大多数研究者仍然认为Ⅱ型代谢型谷氨酸受体位于突触前而不是突触后［9］；由于本研究中采用的Ⅱ组代谢型谷氨酸受体的抗体识别mGluR2胞内C末端的813872段残基，而mGluR2和mGluR3胞内C末端呈80％的同源性，因此因而不能完全排除猕猴脊髓中没有mGluR3存在的可能性.
图1代谢型谷氨酸受体在成年猕猴脊髓中的分布 略
组代谢型谷氨酸受体虽然种类较多，但是各个亚型在中枢神经系统中的分布仍有区别.MGluR4分布密度最高的是小脑；mGluR6仅分布在视网膜中；mGluR8集中分布在嗅束，迄今为止没有见到mGluR6 和mGluR8在脊髓中分布的报道；中枢中分布最广的是mGluR7.在大鼠脊髓中mGluR7已被证实存在于初级传入神经末梢，主要是谷氨酸能末梢的突触前膜活性区，可作为自受体而发挥对谷氨酸释放的负反馈调节作用［10］.本研究结果也表明在猕猴脊髓中mGluR7也主要分布于初级传入神经末梢的分布区域中.然而，它们是否也存在于后角初级传入神经末梢上，目前还没有这方面的报道，需要进一步的神经束路追踪实验或背根切断实验以及超微结构研究来加以验证.
代谢型谷氨酸受体是一类与G蛋白耦联的调节离子通道和第二信使生成酶的特异受体.其多种亚型的存在，反映出它们在功能上的多样性和复杂性.不同亚型的受体具有不同的胞内信号转导机制.它们对谷氨酸介导的突触传递的调节作用可以表现为增强作用，也可以表现为抑制效应.最终效应取决于局部神经环路的构成.有证据表明它们可以直接影响到中枢神经系统损伤后的修复［12,13］.本研究结果提示，不同亚型的代谢型谷氨酸受体在成年哺乳动物脊髓水平的信息传递与整合过程中可能具有重要的功能调节作用.
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