肌苷对帕金森病小鼠模型的神经保护作用

【关键词】  小鼠

　　Inosine is neuroprective against MPTPinduced  Parkinsons  disease  in C57BL mice

　　【Abstract】 AIM: To study the neuroprotective effects of inosine on  1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine（MPTP）induced Parkinsons disease（PD） in C57BL mice. METHODS:  The PD models were formed with intraperitoneal injections of MPTP. Inosine was administered intraperitoneally to mice 30 min prior to MPTP. The effects of inosine and MPTP on the behavioral exhibition, the number of dopamine (DA) neurons in the substantia nigra and the density of tyrosine hydroxylaseimmunoreactive (THir) nerve fibers in the striatum, and the level of DA in the striatum were studied by behavioral test, immunohistochemical analysis and fluorospectrophotometry. RESULTS:  The scores of locomotion, Rotarod and swim test decreased by about 45％ and 43％ and 22％, respectively. The number of DA neurons in the substantia nigra declined by about 58％, the density of THir nerve fibers also decreased, and the level of DA in the striatum declined by about 88％. Inosine, given prior to MPTP, attenuated the effects of MPTP. The scores of locomotion, Rotarod and swim test declined only by about 5％ and 11％ and 12％, respectively, the number of DA neurons in the substantia nigra declined by only about 43％ and the level of DA in the striatum declined only by about 71％. CONCLUSION:  Inosine is neuroprective against MPTPinduced lesions in C57BL mice.

　　【Keywords】 inosine；1Methyl4pheny1,2,3,6tetrahydropyridine；Parkinson disease；nearaprotective agents；mice

　　【摘要】目的： 观察肌苷对MPTP致帕金森病（PD）小鼠模型的神经保护作用.方法： 用MPTP建立C57BL小鼠PD模型，在MPTP前给予肌苷，通过行为学检测（自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验）、免疫组织化学和荧光分光光度法，观察肌苷对PD小鼠模型的行为学表现、黑质多巴胺（DA）神经元和纹状体酪氨酸羟化酶免疫反应阳性（THir）神经纤维以及纹状体DA水平的影响.结果： 给予MPTP后，小鼠行为学计数降低，自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验分别降低约45％、43％和22％，黑质DA神经元数目减少约58％，纹状体THir神经纤维密度减低，纹状体DA水平明显降低约88％，提前给予肌苷后降低程度减轻，自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验降低程度分别约为5％、11％和12％，黑质DA神经元数目减少约43％，纹状体DA水平降低约71％，两组相比有显著性差异（P＜001）.结论： 肌苷对MPTP所致的C57BL小鼠的神经损伤具有保护作用.

　　【关键词】 肌苷；1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶；帕金森病；神经保护药；小鼠

　　0引言

　　帕金森病（Parkinsons disease,PD）是一种临床常见的神经系统退变性疾病，是中老年人常见的致残疾患之一.目前所知，其主要是由于黑质多巴胺（Dopamine,DA）能神经元坏死、凋亡，细胞数目减少，使黑质－纹状体通路DA释放减少，出现多巴胺乙酰胆碱失衡，患者出现静止性震颤、肌张力增高、运动减少等一系列症状，严重影响患者的生活质量.研究显示PD的发病与遗传和环境等多种因素相关，1甲基4苯基1、2、3、6四氢吡啶（1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine,MPTP）可以导致人类及灵长类、小鼠等多种动物产生PD样症状，为PD研究提供了新的途径.肌苷（inosine,INO）是腺嘌呤核苷和核苷酸代谢的中间产物之一，临床上长期作为能量营养剂用于多种疾病如肝脏和心血管疾病的辅助.近期研究发现，肌苷在神经系统的损伤与修复中也具有重要的营养和保护作用.本研究利用常用的MPTP致C57BL小鼠PD模型，探讨肌苷在PD中的神经保护作用.

　　1材料和方法

　　11动物和分组8 wk龄雄性C57BL小鼠（第四军医大学实验动物中心提供），体质量25～27 g，安静环境饲养，自由取食饮水，人工昼夜节律（12～12 h）.将动物随机分为3组： 生理盐水组（Saline组）；MPTP组；肌苷+MPTP组（INO+ MPTP组），每组10只.第1~3日INO+MPTP组给予肌苷60 mg/kg ip 1次/d，Saline组、MPTP组给予等量生理盐水ip 1次/d，第4~10日INO+MPTP组给予肌苷60 mg/kg ip，30 min后MPTP 30 mg/kg ip 1次/d，MPTP组给予等量生理盐水ip 30 min后MPTP 30 mg/kg ip 1次/d，Saline组给予等量生理盐水ip 1次/d.

　　12试剂和仪器MPTP，INO和DA标准品为Sigma公司产品，小鼠抗酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体，生物素化兔抗小鼠二抗，ABC试剂盒为Calbiochem公司产品，其余试剂为国产分析纯.用001 mol/L盐酸将DA配制成100 mg/L，保存于0～2℃，使用前用001 mol/L盐酸稀释配制成标准应用液2 mg/L.酸化正丁醇： 100 mL正丁醇中加入0085 mL浓盐酸；1/15 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 72）： KH2PO4  035 g和Na2HPO4・12H2O 145 g溶于975 mL去离子水中，用10 mol/L NaOH或H3PO4调至pH 72，最后定容到100 mL；01 mol/L碘试剂： KI 1 g溶于重蒸馏水后加入I2 025 g，再加重蒸馏水至20 mL，贮于棕色瓶中，避光保存；碱性亚硫酸钠： 025 g亚硫酸钠（Na2SO3）溶于5 mol/L NaOH 9 mL中，再加水1 mL混匀，临用前配制；01 mol/L EDTA溶液（pH 70）： EDTA2Na.2H2O 0371 g溶于95 mL 乙酸钠（1 mol/L）中，用10 mol/L NaOH调pH 70，最后用乙酸钠（1 mol/L）溶液加到10 mL，贮存于冰箱备用.UGO BASILE 7750型Rotarod仪，岛津RF5000荧光分光光度仪.

　　13行为学检测在停药后第3日，进行下述行为学检测.

　　131自主活动计数参照Kawai H［1］的测试方法，自制30 cm×30 cm×15 cm的有机玻璃盒，底部刻出6 cm×6 cm的格子，在安静、光线较暗的环境中检测.小鼠适应环境10 min后，计数5 min内小鼠移动的格子数，连续测5次取平均值.

　　132Rotarod检测Rotarod实验需要动物在滚轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的检测运动协调性的实验.滚轴直径6 cm，转速20 r/min，连续测20次取平均值.

　　133游泳实验参照Donnan GA［2］的测试方法，将受试小鼠放入一个20  cm×30 cm×20 cm规格的有机玻璃水箱中，水深10 cm，水温为22～25℃.评分标准如下： 在1 min内能连续不断游泳者记30分；大部分时间游泳仅偶尔漂浮者记25分；漂浮时间占整个受试时间 50％以上者记20分；偶尔游泳者记15分；偶尔用后肢游动并漂浮在水箱一边者记10分.检测5次取平均值.

　　14黑质及纹状体免疫组织化学检测行为学检测后，每组取5只小鼠行黑质及纹状体免疫组织化学检测.5 g/L戊巴比妥钠1 mL腹腔麻醉后，开胸经主动脉先以9 g/L生理盐水15 mL冲洗血液，再用含40 g/L多聚甲醛的01 mol/L的磷酸缓冲液（PBS，pH 72）100 mL先快后慢灌注固定1 h灌毕立即取脑，在含300 g/L蔗糖的PBS内过夜（4 ℃）至组织沉底.小鼠脑图谱，在恒冷箱（－22℃）行中脑黑质和纹状体冠状切片，片厚30 μm，收集于001 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS, pH 72）内.免疫组织化学染色步骤如下： 3 mL/L过氧化氢甲醇溶液（300 mL过氧化氢1 mL+甲醇80 mL+ PBS 19 mL）30  min，3 g/LTriton X100的PBS 30 min，浸入小鼠抗TH单克隆抗体（1∶3000）孵育48 h（4℃），浸入生物素化兔抗小鼠二抗（1∶500）孵育2 h（室温），浸入ABC复合物（1∶500）孵育2 h（室温），蒸馏水快速冲洗后硫酸镍胺加强DAB蓝色反应法显色20～30 min，当阳性产物呈深蓝色而背底清晰时蒸馏水冲洗3次终止显色.以上步骤每步后均需001 mol/L PBS清洗3次，每次10 min.其中一抗用含10 mL/L小牛血清和3 g/L的Triton X100的PBS稀释，二抗和ABC复合物用PBS稀释.贴片，脱水，透明，中性树胶封片.每只小鼠黑质取头端、中部、尾端切片3张，取大脑脚中点上方区域，在200×高倍镜下计数TH免疫反应阳性（THir）神经元个数，取平均数.

　　15纹状体DA水平检测在行为学检测后，每组取5只行纹状体DA水平荧光分光光度法检测.将小鼠迅速断头、取脑，放入预冷的生理盐水中，去除脑膜和血液，滤纸吸干水分，在冰皿上剥离纹状体，称质量后置于含有少量冰冷的酸化正丁醇的匀浆器中，在冰水浴中制成匀浆，转移至具塞刻度离心管内，并用酸化正丁醇补充至3 mL，按以下步骤测DA浓度： 匀浆液振荡1 min，离心（2500 r/min）5 min，上清液15 mL + 1/15 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 72）15 mL，振荡1 min，离心5 min，水相05 mL + EDTA溶液04 mL混合，加碘试剂02 mL混合、静置，准确反应2 min，加碱性亚硫酸钠05 mL混合、静置，准确反应2 min，加6 mol/L乙酸06 mL，沸水浴20 min，冷却后检测荧光强度（波长： 激发光320 nm，发射光370 nm）.每批实验均需空白管和标准管.空白管： 取001 mol/L盐酸02 mL，用酸化正丁醇补充至3 mL，其余操作同样品管.标准管： 取标准应用液02 mL，用酸化正丁醇补充至3  mL，其余操作同样品管.

　　统计学处理： 实验结果采用x±s表示，SPSS100统计软件行单因素方差分析和SNKq组间两两比较，P＜005为有统计学意义.

　　2结果

　　21小鼠给予MPTP后的一般表现小鼠在给予MPTP后3～5 min，出现震颤、运动减少、弓背、后肢张开、步态不稳、竖尾、竖毛等改变，个别出现癫痫样发作，约30～60 min后上述症状逐渐减轻，24 h后基本恢复正常，但随着给药次数的增加，急性反应表现反倒减轻，但24 h后其运动减少、肢体僵硬、步态不稳、反应迟缓的表现越来越明显.

　　22行为学检测结果见Tab 1,MPTP组出现小鼠行为学计数降低，自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验分别降低约45％、43％和22％，提前给予肌苷的INO+MPTP组降低程度减轻，自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验降低程度分别约为5％、11％和12％，与MPTP组相比，自主活动计数和Rotarod检测（P＜001)以及游泳实验（P＜005）具有显著性差异.

　　表1MPTP和肌苷对小鼠行为学的影响　略

　　图1Saline,MPTP和INO+MPTP组小鼠的黑质THir神经元数目　略

　　图2Saline组、MPTP组和INO+MPTP组小鼠的黑质THir神经元及纹状体THir神经纤维　略

　　23黑质及纹状体免疫组织化学检测结果见Fig 1，2.MPTP组与Saline组相比，黑质THir神经元数目明显减少约58％，残留神经元皱缩，突起减少或消失，纹状体THir神经纤维密度减低，提前给予肌苷后黑质THir神经元数目减少约43％，与MPTP组相比有显著性差异（P＜001）.

　　24纹状体DA水平检测结果见Fig 3.MPTP组与Saline组相比，纹状体DA水平明显降低约88％，而INO+MPTP组提前给予肌苷后降低程度约为71％，与MPTP组相比有显著性差异（P＜001）.

　　图3Saline，MPTP和INO+MPTP组小鼠的纹状体DA水平　略

　　3讨论

　　MPTP的神经毒性作用发现于20世纪80年代，它能导致人类及多种动物出现PD样症状.MPTP进入细胞内以后，被位于线粒体外膜的单胺氧化酶B催化生成甲基－苯基吡啶离子（MPP+），释放到细胞外间隙，被临近的DA能神经元轴突末梢通过突触前膜DA转运体摄取，并逆向运输至神经元胞体，被线粒体主动摄取而浓集，特异性抑制氧化呼吸链复合体I和传递，减少ATP生成，造成DA能神经元ATP耗竭，并且通过促进反应氧族和过量一氧化氮的生成而发挥毒性作用，对DA能神经元造成选择性的损伤而出现坏死和凋亡.MPTP的神经毒性作用已在多种动物中得到证实，包括灵长类、小鼠、大鼠、猫、猪和金鱼等.在接受MPTP的小鼠和灵长类脑内黑质DA能神经元大量死亡，纹状体TH阳性纤维大量丧失，纹状体DA及其代谢产物DOPAC、HVA水平均明显降低，也有黑质纹状体小胶质细胞和星形细胞的增生和蓝斑、下丘脑等区的损伤，与PD患者的改变基本相同.MPTP对C57BL小鼠作用明确，是目前最常用的PD动物模型之一.

　　肌苷是临床常用的能量营养剂，在体内肌苷的生成有两条途径： 腺嘌呤核苷酸在腺苷酸酶的催化下生成腺苷，腺苷在腺苷脱氨酶作用下生成肌苷；或者腺嘌呤核苷酸在嘌呤脱氨酶催化下生成次黄嘌呤核苷酸，再经核苷酸酶去磷酸并加一分子水后生成肌苷.肌苷的分解则通过核苷磷酸化酶生成次黄嘌呤和1－磷酸核糖，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶催化下经黄嘌呤生成代谢终产物尿酸.1－磷酸核糖在磷酸核糖变位酶的作用下转变为5－磷酸核糖，其在磷酸核糖焦磷酸合成酶催化下生成磷酸核糖焦磷酸（PRPP），PRPP参加嘌呤核苷酸的从头合成途径；次黄嘌呤则与PRPP生成次黄嘌呤核苷酸，参加嘌呤核苷酸的补救合成途径.生成5磷酸核糖后，还可以通过磷酸戊糖通路在无氧糖酵解时产生ATP（3分子肌苷可产生8个分子的ATP），由此肌苷可以参加ATP的生成和其他腺嘌呤核苷酸的代谢过程.

　　研究发现，肌苷不仅仅增加ATP生成，参加能量代谢，而且在神经系统的损伤和修复中也具有重要的营养和调节作用.Litsky ML等使用鱼藤酮抑制呼吸链，对培养的鼠胚脊髓细胞进行损伤，当给予肌苷后发现明显提高神经元的存活率和正常形态细胞比例，并表现出浓度依赖性 ［3］.肌苷对硫酸锌诱导的体外培养PC12细胞的损伤也可以增加细胞存活率，维持细胞正常形态，具有直接的保护作用 ［4］.除了对神经元的直接保护作用之外，肌苷还可以促进神经突起的生长，恢复神经突触的功能.Benowitz LI等人发现肌苷可促进体外培养的金鱼和幼鼠视网膜神经节细胞轴突的生长，伴有促进轴突再生相关基因如生长相关蛋白GAP43，E587Ag，Neurolin，细胞黏附分子L1和Tα1的表达［5，6］.在体内实验中，将成年大鼠锥体交叉平面以上的一侧皮质脊髓束切断，于对侧大脑皮质感觉运动区用微泵将肌苷持续注入，结果发现未损伤侧皮质锥体细胞的轴突侧支大量出芽，并生长到损伤侧已溃变的颈髓白质中，形成新的突触和神经通路，免疫组织化学证明损伤区有大量的GAP43蛋白表达［7］.同样，在阻断一侧大脑中动脉的大鼠半侧脑皮层缺血模型，通过微泵将肌苷持续注入枕大池或者侧脑室，结果发现与Saline组相比，虽然梗死区域大小无差别，但未损伤侧皮质红核束和皮质脊髓束均有明显的再生轴突侧支生长进入损伤侧，伴有高水平的GAP43蛋白表达，同时观察到大鼠瘫痪侧上肢运动功能有明显恢复［8］.最近研究表明，在成年大鼠视神经横断以及移植自体外周神经，给予ip肌苷，则轴突切断的视网膜神经节细胞存活数增加，以及在移植的外周神经内出现明显增加的视网膜神经节细胞再生轴突［9，10］.

　　本研究结果显示，肌苷对MPTP致帕金森病小鼠模型也具有神经保护作用.肌苷的作用可能通过以下机制：   ① 增加ATP的生成，减轻MPTP抑制线粒体呼吸链后造成的能量耗竭，提高黑质DA神经元存活率；② 肌苷可能通过抑制核蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）从而减少受损细胞内ATP的消耗，防止能量耗竭，同时PARP的活性被肌苷抑制后还可阻止一氧化氮合酶的作用过程，减少一氧化氮合成，结果使过亚硝酸盐生成减少，保护细胞的膜性结构，减轻MPTP的神经毒性［4］；③ 肌苷可以升高神经元内Bcl2水平，而Bcl2可抑制MPTP诱导的神经元凋亡，阻止细胞的坏死过程［4］.④ 肌苷降解形成尿酸，而尿酸可以保护神经元防止缺氧损伤，清除过亚硝酸盐和氧自由基［11，12］；⑤ 肌苷可以通过细胞膜易化扩散进入神经元内，促进神经细胞突起的生长，恢复损伤的突触功能，可能的机制包括激活胞内的蛋白激酶N；催化生成cAMP，cAMP作为第二信使参与神经突起的生长；抑制多种抑制性因子，如激动Gi蛋白的髓鞘相关糖蛋白等，从而促进细胞突起的生长，保留残存神经元的突触功能［4，5］.本研究中提前给予肌苷后，MPTP对C57BL小鼠黑质DA能神经元的损伤减轻，纹状体的THir神经纤维得以保存，纹状体DA浓度降低程度减轻，是行为学检测反映的PD症状较轻的病理基础.通过本研究证实了肌苷对MPTP致帕金森病小鼠模型的神经保护作用，为肌苷应用于帕金森病的预防提供了实验依据，为进一步深入研究神经组织保护机制和帕金森病奠定了基础.

　　【】

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