反流致大鼠Barrett

                                                     作者：张涛　朱以芳　张峰　王云杰　程庆书　李小飞

【关键词】  Barr　　

               Expression and significance of inducible nitric oxide synthase in formation of Barretts esophagus and its progression to esophageal adenocarcinoma in a rat model

　　【Abstract】  AIM:  To investigate the expression and significance of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the formation of Barretts esophagus (BE) and its progression to esophageal adenocarcinoma (EAC) in a rat model. METHODS:  Sixtyfive eightweekold male SpragueDawley rats underwent endtoside gastrojejunostomy, followed by endtoside esophagojejunostomy approximately 05 cm distal to the gastrojejunostoma to produce the duodenogastroesophageal reflux model group. Another 10 rats undergoing a sham operative procedure were taken as a control group. Some animals were sacrificed and their esophageal samples were taken from the model group at week 1, 4, 8, 12, 16 and 20 respectively after surgery and from the control group at week 20. Longitudinally esophageal paraffin slides were made and used for hematoxylin and eosin staining and iNOS immunohistochemical staining. Pathological changes and expression of iNOS in the distal onethird of the esophageal mucosa were detected microscopically. RESULTS: ① No pathological changes were found in the control group. Significant esophagitis were observed in the model group after surgery. There was a progression in epithelial cell proliferation and inflammation from mild to severe in the distal onethird of the esophagus, and BE and EAC were observed. The incidence of BE and EAC increased with time: 375% and 0% at week 8, 60% and 10% at week 12, 90% and 30% at week 16, 86.6% and 533% at week 20. ② Immunohistochemical staining of iNOS was negative in the control group. In the model group positive expression of iNOS in the distal onethird of the esophagus was observed in 0%, 0%, 50%, 80%, 100% and 100% of the rats at week 1, 4, 8, 12, 16 and 20 respectively and in 100% of the rats with BE and EAC. Positive iNOS staining was observed in the stromal macrophages directly beneath the epithelium. CONCLUSION:  Excessive nitric oxide produced by iNOS in the stromal macrophages may contribute to the pathogenesis of BE and its progression to EAC.

　　【Keywords】 Barrett esophagus；esophageal neoplasms;adenocarcinoma；nitric oxide synthase;nitricoxide

　　【摘要】  目的： 探讨反流致大鼠Barretts食管（Barretts esophagus,BE）及食管腺癌（esophageal adenocarcinoma,EAC）发生过程中局部诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达及意义.方法:  将8 wk龄雄性SD大鼠65只，通过手术建立十二指肠胃食管反流模型组，分别于术后1,4,8,12,16,20 wk随机取若干动物食管全长，制成纵切面石蜡切片，分别进行苏木精伊红（HE）染色及iNOS免疫组化染色，在光镜下观察食管黏膜病变及iNOS染色结果.另设无反流对照组（10只）.结果： ① 对照组未见病变；模型组术后引发反流性食管炎，食管下段黏膜炎症和增生的程度随观察时间的延长逐渐加重，并有部分为BE和起源于BE的EAC.BE、EAC最早分别出现于术后第8周和第12 周，在以后的各时间点两者发生率呈上升趋势，到术后20 wk达866%和533%.② 对照组iNOS阴性.模型组术后1,4,8,12,16,20 wk食管下段黏膜iNOS表达率分别为： 0,0,50%,80%,100%,100%，阳性染色位于上皮下的巨噬细胞.BE,EAC均见于iNOS阳性者.结论:   反流致BE及EAC过程中局部iNOS产生的过量一氧化氮具有重要的病理作用，可能参与致癌过程.

　　【关键词】  Barretts食管；食管肿瘤；腺癌；一氧化氮合酶；一氧化氮

　　0引言

　　Barretts食管（Barretts esophous,BE）是EAC惟一公认的危险因素，而BE又是在反流性食管炎的基础上长期发展而来［3］.慢性炎症长期以来一直被认为是引发癌症的危险因素.随着一氧化氮（NO）作为一种炎性细胞产物以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在人类许多癌症中的表达被发现，越来越多的证据表明NO过量生成在癌症发生中可能具有重要的病理作用［4，5］.我们以自行建立的大鼠十二指肠胃食管反流（duodenogastroesophageal reflux，DGER）动物模型［6］为基础，试图对iNOS在反流诱发BE,EAC发展过程中的表达及意义进行探讨.

　　1材料和方法

　　11材料8 wk龄雄性SD大鼠75只，体质量（200±20）g，购于第四军医大学实验动物中心，SPF条件饲养.iNOS抗体、SABC试剂盒购于武汉博士德公司.

　　12方法

　　121模型的建立及标本的获取通过手术建立DGER模型组（n=65）和无反流对照组（n=10）（见［6］）.模型组分别于术后1，4，8，12，16，20 wk随机抽取存活大鼠5，5，8，10，10和15只，死亡12只.对照组于术后20 wk取全部存活大鼠10只，取食管全长，制成纵切面石蜡切片.

　　122苏木精伊红染色光镜下观察病变，炎症程度根据炎细胞浸润密度评分： 同正常无炎细胞浸润为0分；每高倍镜视野有少量散在炎细胞浸润为1分；中等密度浸润为2分；高密度浸润为3分.增生程度根据基底细胞层厚度评分： 正常食管复层鳞状上皮有1~3层基底细胞为0分；增生的基底细胞层占整个上皮厚度的1/3以下为1分；1/3~2/3为2分；2/3以上为3分.BE,EAC的组织学标准见Fein等［7］的报道.

　　123iNOS免疫组化染色按试剂盒说明进行.切片经30 mL/L H2O2处理后，以正常山羊血清封闭，加入一抗1∶100 iNOS抗体4℃过夜，二抗为1∶100生物素化山羊抗兔，三抗为1∶100 ABC复合物孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素衬染细胞核，常规脱水、透明、封片.光镜下胞质呈棕色颗粒状着色为阳性，对阳性细胞进行观察和计数.

　　统计学处理： 采用SPSS100统计软件，方差分析用于分析组间均数差别，方差不齐时采用非参数秩和检验，Fishers精确检验用于比较两个率的差别，P005表示两组差别具有显著性的意义.

　　2结果

　　对照组全部存活；模型组死亡12只，死亡率为185%.

　　21组织学观察对照组未见病变.模型组术后引发反流性食管炎，食管下段黏膜炎症和增生的程度随观察时间的延长逐渐加重（Tab 1），并有部分为BE和起源于BE的EAC（Fig 1）.BE，EAC最早分别出现于术后第8周和第12周，在以后的各时间点两者发生率呈上升趋势，到术后20 wk达866%和533%（Tab 1）.食管炎局限于食管中、下段，上段未见病变.BE均发生在食管下端，紧邻吻合口.起源于BE的EAC均发生于吻合口处，常侵透食管肌层.

　　22iNOS的表达对照组iNOS阴性.模型组术后1，4，8，12，16，20 wk食管下段黏膜iNOS表达率分别为： 0，0，50%，80%，100%，100%（Tab 1），阳性染色位于上皮下的巨噬细胞（Fig 2，3），大多数见于食管下段，少数见于中段，上段阴性.BE，EAC均见于iNOS阳性者.

　　表1模型组不同时间点食管下段黏膜病变及iNOS的表达　略

　　图1－图3略

　　3讨论

　　NO由一氧化氮合酶（NOS）催化L精氨酸生成.NOS有结构型（cNOS）和诱导型（iNOS）之分.iNOS在生理状态下通常不表达，当受到细胞因子等刺激后可被诱导激活而表达.NO在体内的作用具有双重性，它不仅参与许多重要的生理过程，当其合成不足或生成过量时也参与众多的病理过程［7］.iNOS是体内NO过量生成的主要基础，其活性不依赖钙离子，一旦诱导合成即可持续产生大量NO，直至底物耗尽［8］.过量的NO可导致细胞毒性和DNA损伤［9］.细胞毒性机制有： ① 与超氧阴离子反应生成过氧化亚硝酸阴离子（一种强氧化剂）.它可使巯基氧化，导致能量代谢或抗氧化有关的酶失活；使酪氨酸硝基化，使超氧化物歧化酶丧失保护作用并影响重要的信号通路；强烈抑制线粒体氧化呼吸作用并引起脂质过氧化.② 与铁硫基团中的铁发生配位结合抑制铁硫酶活性，或通过过氧化亚硝酸根使铁硫酶失活，从而干扰能量代谢和DNA合成.③ 代谢过程中可生成许多毒性中间产物，如： NO2+,OH,OH・,NO2等.DNA损伤机制有：① 与DNA链中的胺发生反应，导致DNA碱基脱氨基和突变.② NO或其代谢产物过氧化亚硝酸根及OH・引起DNA氧化.③ 使胺亚硝基化生成亚硝胺，多数为强致癌物.④ 抑制DNA修复酶O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，抑制DNA损伤的修复.

　　通常机体维持细胞正常功能所需的NO稳定在一个较低的水平，所以不会引起细胞毒性和DNA损伤.当发生炎症而引起继发性NO合成增多时，尽管在短时间内对机体的防御功能有益，但也会产生一些有毒性的中间产物，导致组织损伤和基因毒性，从而产生潜在的致癌效应［4］.

　　我们自行建立的大鼠DGER模型较为接近人类胃食管反流病的病理特点［6］.采用这一模型，我们成功模拟了人类胃食管反流病的整个发展过程（反流性食管炎BEEAC），并对这一过程中食管黏膜iNOS的表达进行了动态研究.我们观察到无反流对照组食管黏膜未见病变，其iNOS阴性，表明正常食管黏膜没有iNOS表达.模型组术后反流引发食管黏膜损伤，损伤引起炎症和上皮增生修复，随着对损伤性物质暴露时间的延长，炎症和上皮增生逐渐加重.在此过程之初的术后1~4 wk iNOS阴性，而术后8 wk其阳性率已达50%，说明iNOS的诱导生成最早出现在反流引发食管炎后的4~8 wk，在食管炎急性期并无其诱导生成，它是慢性反复性炎症刺激的产物.模型组食管上段黏膜未受反流影响没有引起炎症和增生病变，其iNOS阴性，也从反面证实了iNOS的诱导生成与局部炎症病变的关系.急性炎症通常以中性粒细胞浸润为主，而慢性炎症往往以巨噬细胞浸润为特征.iNOS阳性染色全部见于上皮下的巨噬细胞，而上皮细胞阴性，表明iNOS的诱导生成并非食管炎所特有，而是慢性炎症的共有特性.随着反流损害的持续，在以后的各时间点，食管炎愈加严重，与之相应食管下段黏膜iNOS的表达率迅速升高，部分iNOS阳性者发展为BE、EAC，且发生率呈上升趋势，而iNOS阴性者无一发展为BE、EAC，这充分表明局部NO的过量生成在BE及其腺癌发展过程中发挥着重要作用.巨噬细胞中iNOS诱导生成后可持续产生高浓度的NO［8］.NO为气体分子，生成后可迅速弥散至临近上皮.过量的NO会产生细胞毒性和DNA损伤［8］.细胞毒性将进一步加重组织损伤并促进上皮细胞增生修复，而细胞增生又可促使DNA损伤转化为突变，进而可能引起癌基因激活或抑癌基因失活.这很可能便是所有BE、EAC均发生于iNOS阳性者的原因之一.过量NO的长期作用很可能是Barretts化生及其癌变的基础.

　　癌症的发生是一个长期的多因素造成的分阶段的过程.由于在癌症发生和进展的不同阶段细胞和机体内环境会发生变化，加之NO作用的多样性，决定了它在癌症病变的不同时期可能具有不同的作用［9］.本实验结果表明，在反流致BE及其腺癌过程中局部iNOS产生的过量NO具有重要的病理作用，可能参与致癌过程.其作用机制还有待于更深入的研究.

　　【】

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