格列齐特对糖尿病大鼠心肌ATP敏感性钾通道mRNA表达的影响

                                              作者：　吴国亭，徐倍，李文君，程晓芸，盛春君

【关键词】  糖尿病

    Effect of Gliclazide on mRNA expression of ATPsensitive potassium channels in myocardium of diabetic rats

　　【Abstract】 AIM: To observe the effect of Gliclazide on mRNA expression of ATPsensitive potassium channels（KATP） in myocardium of diabetic rats. METHODS:  Rat diabetic model was made by streptozotozin ip and fed on highfat diet for 6 weeks. The rats were then allocated randomly into 3 groups: the diabetes model group, the Gliclazide group and the positive control group（treated with insulin）. A normal control group was also set up. KATPmRNA expression in myocardial cells of the rats was detected by the reverse transcriptasepolymerase chain reaction（RTPCR）. RESULTS:  There was no significant difference in mRNA expression levels of KATP in heart between diabetic, insulintreated diabetic and normal control groups（P>0.05）. Comparison between Gliclazidetreated diabetic and nontreated diabetic rats showed that there was no change in mRNA levels of KATP in heart（P>0.05）. CONCLUSION:  The streptozotocininduced diabetes itself does not affect the mRNA expression of KATP（SUR2 and Kir6.2） in myocardial tissues. Gliclazide with treatment dosage has no effect on gene expression of KATP.

　　【Keywords】 diabetes mellitus；myocardium；ATPsensitive potassium channels；Gliclazide

　　【摘要】 目的：观察格列齐特(Gliclazide)对糖尿病大鼠心肌组织ATP敏感性钾通道mRNA表达的影响. 方法：采用链脲佐菌素小剂量ip结合高脂饮食饲养形成2型糖尿病大鼠模型，随机分为糖尿病对照组、糖尿病胰岛素组和糖尿病格列齐特组，另设正常对照组. RTPCR检测ATP敏感性钾通道mRNA表达. 结果：糖尿病组、糖尿病胰岛素治疗组和正常对照组ATP敏感性钾通道mRNA表达水平无差异（P>0.05）. 格列齐特治疗组ATP敏感性钾通道mRNA表达水平较正常对照组和糖尿病组无明显变化（P>0.05）. 结论：链脲佐菌素诱导的实验性糖尿病不影响心肌ATP敏感性钾通道mRNA表达水平；治疗剂量的格列齐特对ATP敏感性钾通道mRNA的表达无影响.

　　【关键词】 糖尿病；心肌；ATP敏感性钾通道；格列齐特

　　0引言

　　磺脲类药物（sulfonylureas，SU）治疗糖尿病尤其是对合并心血管疾病的糖尿病的安全性一直有争议［1］. SU对心血管系统产生不利影响的作用机制可能是它与心肌和血管平滑肌上ATP敏感性钾通道（ATPsensitive potassium channels，KATP）相结合，结合位点主要是该通道的调节亚基磺脲类药物受体（sulfonylurea receptor，SUR），此外内向整流钾通道6.2（inward rectifier potassium channel 6.2，Kir6.2）亚基上也有SU低亲和力位点；线粒体膜上KATP通道被阻滞也有一定作用［2］. 但目前争议的焦点是心肌KATP通道对SU的反应是否因患糖尿病而异，不同SU对心血管系统的影响是否相同，治疗剂量的SU是否足以对心血管系统产生不良影响［3］？我们应用RTPCR的方法观察正常和糖尿病Wistar大鼠心肌KATP通道mRNA表达，并用胰岛素作对照观察格列齐特(Gliclazide)治疗剂量对基因表达的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　选用8 wk龄雌性Wistar大鼠，体质量（200±20） g，购自中科院实验动物中心. 适应性饲养1 wk后造模. 造模组用高脂饲料［4］喂养6 wk后测血糖、血浆胰岛素和血三酰甘油、胆固醇水平. 禁食12 h，将链脲佐菌素（临用前用0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液配成20 g/L，pH 4.2，4℃）按25 mg/kg单次ip，72 h后取尾血测血糖，血糖≥16.67 mmol/L为造模成功. 平衡喂养3 d后随机分为糖尿病对照组、糖尿病胰岛素治疗组和糖尿病格列齐特组，每组10只. 取体质量、鼠龄相匹配的同批正常大鼠，普通饲料喂养6 wk后等量枸橼酸缓冲液（0.1 mmol/L，pH 4.2，4℃）单次ip，72 h后测血糖在4.7～8.3 mmol/L作为正常对照组共10只. 糖尿病胰岛素治疗组每日16:00～17:00皮下注射预混人胰岛素（优泌林70/30）2～4 U，调整胰岛素剂量使血糖维持在正常水平；糖尿病格列齐特组：格列齐特标准品由施维雅（天津）制药有限公司提供. 每日下午同一时间段以120 mg/kg剂量配制成混悬液灌胃，正常对照组和糖尿病组同时灌胃等量生理盐水. 各组大鼠实验期间按组分笼饲养，自由进食、饮水，饲喂大鼠标准饲料. 连续观察12 wk，然后麻醉下取心肌观察KATP通道mRNA表达. 取尾血，采用葡萄糖氧化酶法测定血糖（美国Lifescan公司的One Touch UltraTM血糖仪）.

　　1.2方法

　　用RTPCR方法检测心肌组织KATP通道各组成亚单位磺脲类药物受体2（SUR2）和内向整流钾通道6.2（Kir 6.2）的基因表达水平. 总RNA提取试剂TrizolTM提取心肌组织总RNA，紫外分光法检测RNA纯度，TBE/琼脂糖电泳检测RNA的完整性. 以Oligo（dT）15为随机引物，总RNA为模板，将RNA逆转录成cDNA. 然后以cDNA为模板，建立PCR反应体系. 根据GenBank提供序列，用Premier 5.0软件设计引物：SUR2 （5′ACACGCTCCGCTCTAGACTG3′，5′GCCAGGCAGAACAGCTGTCT3′，目标产物长231 bp），Kir6.2 （5′TCCAACAGCCCGCTCTAC3′，5′GATGGGGACAAAACGCTG3′，目标产物长167 bp），内参基因GAPDH （5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，目标产物长432 bp）. PCR反应程序为：94℃变性45 s，退火56℃ 1 min，延伸72℃2 min，首次循环94℃预变性4 min，共进行32个循环，最后72℃延伸8 min. PCR结果用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，Gene凝胶图像分析系统测定电泳条带吸光度值，基因表达水平以该基因条带吸光度占内参基因条带吸光度的百分比表示.

　　统计学处理：  数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件处理，前后数据用重复测量数据的方差分析，基因表达量用OneWay ANOVA（单因素方差分析）方法，方差齐性用Leastsignificant difference（最小显著差法）检验.

　　2结果

　　2.1治疗前后体质量和血糖比较实验期间糖尿病对照组2只大鼠死亡，未尸解. 治疗前各组体质量无明显差异（P>0.05）. 治疗12 wk后，正常组大鼠体质量增加明显，糖尿病组消瘦明显. 与正常组比较，实验各组体质量增加缓慢（P<0.05）；但格列齐特组和糖尿病胰岛素治疗组体质量增加较糖尿病组多（P<0.05），糖尿病症状也较模型组轻（表1）. 治疗前糖尿病组、糖尿病格列齐特组及糖尿病胰岛素治疗组血糖水平无明显差异（P>0.05）. 糖尿病格列齐特组血糖治疗后较治疗前下降，差异有显著性（P<0.05），其下降程度较糖尿病胰岛素组小，但无统计学意义（P>0.05）；糖尿病胰岛素治疗组治疗后血糖下降明显（P<0.05）. 治疗后糖尿病组血糖仍高于正常组（P<0.05）；糖尿病格列齐特组和胰岛素组血糖水平虽高于正常对照组，但无显著差异（P>0.05，表1）.表1格列齐特治疗糖尿病大鼠的体质量、血糖和心肌组织ATP敏感性钾通道表达(略)

　　2.2心肌组织ATP敏感性钾通道mRNA表达应用格列齐特治疗12 wk后心肌组织SUR2和Kir6.2 mRNA表达的条带吸光度占内参基因GAPDH条带的百分比在糖尿病组和正常对照组间无差异（P>0.05）；格列齐特治疗组与正常组间差异不显著（P>0.05）；胰岛素治疗组与正常对照组间比较差异亦不显著（P>0.05）. 格列齐特治疗组和胰岛素治疗组比较亦无明显区别（P>0.05，表1，图1）.

　　3讨论

　　显示SU通过阻断心血管质膜和部分线粒体KATP通道的开放而对心血管系统产生不利影响［1］. 但临床实验的结论存在差异，有学者提出SU用于人类降糖的药物浓度很低，不足以引起心肌KATP通道的状态改变［4］. 我们的结果显示链脲佐菌素诱导的实验性2型糖尿病不影响心肌KATP通道各组成亚单位的mRNA水平，这可用糖尿病时葡萄糖代谢特点和KATP通道的生理调节过程解释. 在实验性2型糖尿病大鼠，由于胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗，组织对葡萄糖的摄取和利用减少，乳酸生成增多，耗氧量下降，能量代谢降低［5］，但是除非是严重的代谢紊乱如酮症酸中毒时，组织的KATP通道数量不会因为糖尿病而发生改变，即便是在血糖未控制的情况下仍是如此. 格列齐特是常用的中效SU，降糖效果良好. 我们用格列齐特干预糖尿病大鼠后血糖水平明显下降，说明该剂量是降糖的有效剂量. 该剂量的格列齐特作用于糖尿病大鼠后，并未对大鼠心肌组织KATP通道的组成亚单位SUR2和Kir6.2的mRNA水平产生影响，可以从分子生物学的角度提示治疗剂量的格列齐特在发挥其降糖作用的同时并不影响2型糖尿病大鼠的心血管功能，但仍需进一步基础和临床研究证实.

　　【文献】

　　［1］ Reimann F, Dabrowski M, Jones P, et al. Analysis of the differential modulation of sulphonylurea block of βcell and cardiac KATP channels by Mgnucleotides［J］. J Physiol, 2003,547(1):159-168.

　　［2］  Seino S, Miki T.Physiological and pathophysiological roles of ATPsensitive K+ channels［J］. Prog Biophys Mol Biol, 2003,81(2):133-176.

　　［3］  Gribble FM,Reimann F. Sulfonylurea action revisited: The postcloning era［J］. Diabetologia,  2003, 46(7): 875-891.

　　［4］ Fisman EZ,Tenenbaum A,Motro M,et al. Oral antidiabetic therapy in patients with heart disease. A cardiologic standpoint［J］. Herz, 2004,29(3):290-298.

　　［5］ Marfella R, Di Filippo C, Esposito K, et al. Absence of inducible nitric oxide synthase reduces myocardial damage during ischemia reperfusion in streptozotocininduced hyperglycemic mice［J］. Diabetes, 2004,53(2):454-462.