电离辐射相关低密度寡核苷酸基因芯片的制备

                                                              作者：郭万峰，王升启，黄坚，郭国祯

【关键词】  肺癌

    Fabrication of lowdensity ionizing radiationrelated oligonucleotide microarray

　　【Abstract】 AIM: To fabricate an oligonucleotide microarray applied to ionizing radiation. METHODS:  According to the genes reported previously in radiation responses and their family genes or related genes, oligonucleotide microarray was designed. mRNA sequences of these genes were obtained from the GenBank. Specific probes were designed with Mprobe software and synthesized by AB18909 DNA synthesis system and spotted onto aldehydecoated glass slides using Cartesian Pix sys 3000 spotter in our laboratory. Using this microarray, we identified genes showing altered expression in different radiosensitive lung cancer cell lines. To provide independent confirmation of microarray data, semiquantitative RTPCR was performed on four genes. RESULTS:  Lowdensity radiationrelated oligonucleotide microarray was fabricated successfully, which had 143 genes including 127 involved in stress response, cell cycle progression, DNA damage and repair, apoptosis and proliferation, together with 11 housekeeping genes and 3 luciferase genes as positive controls and 2 rice genes as negative controls. Eighteen differentially expressed genes were screened by this microarray. Four genes were detected by RTPCR, and the results were in accordance with those from the microarray data, even though the value for each mRNA level might be different between the two measurements. CONCLUSION:  The radiationrelated oligonucleotide microarray can be used to investigate the differentially expressed genes in different radiosensitive cancer cells and provide a platform for radiation research.

　　【Keywords】 microarray; ionizing radiation; lung neoplasms; cell line, tumor

　　【摘要】 目的: 构建一种适用于辐射研究领域的低密度寡核苷酸基因芯片. 方法: 根据以往的研究报告，筛选参与辐射生物效应的基因和相关基因，从GenBank获取mRNA序列，使用Mprobe软件设计特异的探针，构建低密度辐射相关的基因芯片.在不同辐射敏感性肺癌细胞系中对该芯片的灵敏度和特异性进行评价，并对一些差异表达基因进行RTPCR验证，以确认芯片检测结果的可信性. 结果: 构建出了辐射相关的寡核苷酸基因芯片,该芯片共含有143个基因,即127个辐射相关基因和16个对照基因.在不同辐射敏感性的A549和NCIH446细胞中，筛选出18个差异表达基因.经RTPCR对4个基因的验证,结果与芯片资料较一致. 结论: 辐射相关低密度寡核苷酸基因芯片可以检测不同辐射敏感性肿瘤细胞的差异表达基因, 为辐射领域的研究提供了一种技术平台.

　　【关键词】 基因芯片；电离辐射； 肺癌;肿瘤细胞系

　　0引言

　　基因芯片技术作为一门新兴的技术，具有高通量、微型化和自动化的特点,被广泛应用于各种组织的表达谱分析［1-2］.近年来也逐渐被应用于检测辐射诱导的相关基因［3-5］.然而，高密度芯片针对性不强，产生过于繁杂的实验资料，不利于分析并且耗时费力，需要较多的资金，不是一般的实验室所能进行的.我们系统的比较了不同技术平台的基因芯片的优缺点后［6］构建了一种适用于辐射研究领域的低密度寡核苷酸基因芯片.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　肺腺癌细胞A549和肺小细胞癌细胞NCIH446(本室保存). 60Coγ源由军事医学院提供. SuperScriptTM II逆转录酶(Invitrogen公司);Cy3dUTP/Cy5dUTP(Amersham公司);RNasin (Promega公司);dNTPs (Invitrogen公司); ImPromIITM逆转录系统(Promega公司);引物为实验室自行合成（表1）.表1PCR引物（略）

　　1.2方法

　　1.2.1辐射相关基因的选择及芯片设计根据辐射生物学效应和国内外的相关，选择了部分与辐射效应相关的人类细胞凋亡基因、细胞周期基因、DNA损伤修复基因、应激信号途径基因作为候选基因.芯片质控采用定量阳性对照和定量内标看家基因、阴性对照，对逆转录、杂交过程进行检测和结果分析.芯片包括143个基因，其中含定量阳性对照荧光素酶基因3个基因，定量内标看家基因11种（aldolase B,ribosomal protein S28,malate dehydrogenase 2, SDHC, 23 kd highly basic protein, ribosomal protein S9, α tubulin, βactin, ribosomal protein L32, GAPDH和ALB），阴性对照为两种水稻EST序列（AU182426和AU182425）.

　　1.2.2寡核苷酸芯片的制备从GenBank中查询所有候选基因的mRNA序列，用大规模寡核苷酸探针设计软件Mprobe进行探针设计［7］，探针长度为40nt，GC含量45％～55％，自身无二级结构. BLAST分析，筛选出基因特异的寡核苷酸探针. 在AB18909 DNA合成仪上进行寡核苷酸的合成.采用标准亚磷酰氨化学方法,5′或3′氨基修饰用NMMTr6氨己基2氰乙基N′,N′ 二异丙基亚磷酰氨(自制),在合成后的最后一步引入.合成完毕后浓氨水55℃脱保护/切割15 h,OPC柱纯化.分光光度计DU640检测寡核苷酸探针的浓度，用3×SSC稀释成0.5 g/L.用Pix sys 7500芯片制备仪将寡核苷酸点到醛基片上，放置过夜，晾干备用.

　　1.2.3细胞培养及照射取本室保存的肺腺癌细胞系A549和肺小细胞癌NCIH446，培养于含有100 mL/L小牛血清和1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃，50 mL/L CO2的孵箱中进行培养.60Coγ射线照射, 吸收剂量率为1.51～1.68 Gy/min.

　　1.2.4肺癌细胞总RNA的提取和荧光标记cDNA的合成用Trizol（Invitrogen life technologies）试剂盒按说明书推荐的操作步骤提取细胞总RNA.用紫外分析和甲醛变性电泳，分析其纯度和完整性.然后进行逆转录荧光标记，两种细胞的总RNA分别用不同的荧光（Cy3和Cy5）标记，具体方法为：总RNA 50 μg，Oligo dT16 1.25 μL，定量阳性对照荧光素酶体外转录mRNA 0.15 μL，RNasin 0.2 μL，混匀，70℃ 温育10 min，冰上冷却.然后加入第一链5×Buffer 2.5 μL，DTT 1.25 μL，MixdNTP 0.5 μL，Cy3/Cy5dUTP 0.5 μL，RNasin 0.3 μL，Superscript II 0.5 μL，42℃水浴2 h.最后用NaOH 65℃处理30～60 min，进行碱变性.乙醇沉淀标记的cDNA.

　　1.2.5基因芯片的杂交和洗涤按照1∶3的比例将标记的cDNA与杂交液（500 mL／L甲酰胺，5×Denhardt液，6×SSC，5 g/L SDS）混匀，将样品加在基因芯片上，42℃杂交3 h.杂交完毕后，分别用1×SSC+2 g/L SDS，0.2×SSC和0.1×SSC洗涤5 min.

　　1.2.6差异表达基因的检测和分析用ScanArray 4000扫描芯片，用GenePix Pro4.0软件进行数据分析和归一化处理. 使用看家基因和阳性对照对Cy3和Cy5扫描结果进行校正，以Cy5和Cy3的荧光强度值-背景值>400和Cy5/Cy3的比值>1.5或<0.75作为判断基因差异表达的条件.

　　1.2.7RTPCR验证芯片杂交结果提取照射后两种肺癌细胞的总RNA，使用ImPromIITM逆转录系统(Promega)进行逆转录和PCR扩增，PCR引物见表1. 实验条件为： 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55～58℃ 30 s, 72℃ 40 s, 共28～30个循环; 72℃ 5 min. 取5 μL PCR 产物在20 g/L琼脂糖上进行电泳，溴化乙锭染色，Quantity one (BioRad)软件进行分析.

　　2结果

　　2.1肺癌A549和NCIH446细胞的辐射敏感性和总RNA制备我们以前的实验显示肺癌A549和NCIH446细胞的辐射敏感性具有明显的差异性［8］, 提取细胞总RNA进行紫外定量和甲醛变性凝胶电泳.结果表明, 细胞总RNA (A260 nm/A280 nm值为1.82～1.98), 28S/18S >1.5, 5S RNA条带不明显,证明获得了高纯度、高完整性的总RNA.

　　2.2辐射相关基因芯片的杂交使用该芯片对A549和NCIH446细胞的样本进行杂交，辐射相关基因芯片的杂交结果见图1，芯片为286个点，143个基因，每个基因两个点，13×11两个阵列,左右重复. GenePix Pro4.0软件进行数据分析和归一化分析，制作散点图(图2). 发现18个基因有明显的改变，8个基因上调，10个基因下调（表2）.表2在A549和NCIH446细胞中差异表达基因的平均比率（略）

　　2.3.1基因芯片的敏感性、特异性和重复性从杂交的芯片结果分析， 定量阳性对照6个点(图1红色方框)和看家基因22个点（图1蓝色方框）均出现较强的信号，两种阴性对照4个点（图1绿色方框）均无信号.说明芯片的检测结果敏感性和特异性是比较好的.芯片的阵列为左右对称，从芯片左右两个矩阵随机选取部分探针对应点，比较其检测信号强度差异.结果变异系数均小于15％，说明芯片的重复性较好.

　　2.3.2RTPCR验证基因芯片结果的可信性提取A549和NCIH446细胞的总RNA，对4个基因（3个差异基因Bcl2， Cyclin B1，PKCα和1个无明显差异的基因p53）进行RTPCR分析，结果见图3.其余基因的变化结果和芯片结果具有较好的一致性，尽管两种方法检测的RNA水平数值可能是不同的.

　　3讨论

　　为了辨别与肿瘤辐射抗性相关的一些基因，需要建立一种筛选这些基因的方法.基因芯片为高通量检测基因表达提供了一个强有力的工具，目前已被应用到电离辐射领域.但是，目前放射领域里还没有一款适用于放射研究的基因芯片.针对辐射诱导的生物学效应，我们构建了辐射相关的寡核苷酸基因芯片，这种小型芯片去掉了众多的干扰因素，有利于生物信息学分析，降低了成本，有利于广泛的应用.

　　电离辐射除了诱导核内DNA损伤，也可诱导一些分子表达，激活信号传导途径.我们在回顾、分析辐射诱导的生物学效应的基础上，根据辐射调节基因和可能调节的基因，通过科室的基因芯片研发技术平台，构建了一款由143个基因构成的寡核苷酸基因芯片.

　　既往研究发现，A549和NCIH446细胞相比较，具有辐射抗性，这种辐射抗性可能是由其DNA损伤修复、细胞增殖和抗凋亡基因所导致的.我们对这两种细胞进行了培养，提取总RNA逆转录标记进行了芯片杂交.使用GenePix Pro4.0软件分析，以看家基因和阳性对照对Cy3和Cy5扫描结果进行校正，芯片具有灵敏性和可重复性，以Cy5和Cy3的荧光强度值-背景值>400和Cy5/Cy3的比值>1.5或<0.75作为判断基因差异表达的条件，筛选出18个差异表达的基因. 为了检测芯片资料的可信度，我们选取了3个差异表达的基因和1个无差异表达的基因，进行了RTPCR的实验验证，结果和芯片资料较一致.尽管数值可能不同，但是具有相同的趋势.

　　实验结果显示出两种细胞中增殖基因、细胞周期基因、损伤修复基因和凋亡基因的明显不同，这些差异表达基因可能是两种同一组织来源细胞异质性的原因.当然，这些基因是否参与了肺癌细胞的辐射抗性，还需要通过其他的实验方法（如反义技术、RNA干涉技术等）进行验证.总之，构建的寡核苷酸基因芯片可以初步筛选出不同辐射敏感性肿瘤细胞的差异基因，对于从分子水平理解肿瘤细胞的辐射抗性具有重要作用，是辐射研究领域里的一个很好的技术平台.

　　【文献】

　　［1］ Schena M, Shalon D, Davis RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray［J］. Science, 1995, 270(5235): 467-470.

　　［2］ Schena M, Shalon D, Heller R, et al. Parallel human genome analysis: Microarray based expression monitoring of 1000 genes ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(20):10614-10619.

　　［3］ Kruse JJ, te Poele JA, Velds A, et al. Identification of differentially expressed genes in mouse kidney after irradiation using microarray analysis ［J］.  Radiat Res， 2004, 161(1): 28-38.

　　［4］ Edwards JS, Battista JR. Using DNA microarray data to understand the ionizing radiation resistance of  Deinococcus radiodurans ［J］. Trends Biotechnol,  2003, 21(9): 381-382.

　　［5］ Guo G, YanSanders Y, LynCook BD, et al. Manganese superoxide dismutasemediated gene expression in radiationinduced adaptive responses ［J］. Mol Cell Biol， 2003, 23(7):2362-2378.

　　［6］ 郭万峰，滕光菊，王升启. 几种基因芯片技术的比较［J］. 生物工程杂志，2004, 24(5)：15-19.

　　［7］ Li W, Huang J, Fan M, et al. Mprobe: Computer aided probe design for oligonucleotide micrroarray ［J］. Appl Bioinformatics, 2002, 1(3):103-106.