三叶因子2基因真核表达载体的构建

                                                  作者：张绍荣，杨晓强，邢锐，宋于刚，陈学清

【关键词】  胃溃疡

    Construction of eukaryotic expression vector of human TFF2 gene

　　【Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector of human TFF2 gene. METHODS: We assembled a TFF2 gene in pfu mix reaction system and cloned it to pGMT easy vector. The positive colonies were first confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing and then were inserted to eukaryotic expression vector pcDNA3.1 and verified by enzyme digestion and sequencing. RESULTS:  After TA colon of synthetic TFF2, the positive colonies were finally verified by sequencing, which were totally in line with the designed coding sequence of TFF2 gene. CONCLUSION:  Eukaryotic expression vector of human TFF2 gene has been successfully constructed, which provides a basis for further investigation of gastric ulcer.

　　【Keywords】 eukaryotic expression vector； TFF2  gene; gastric ulcer

　　【摘要】 目的：构建TFF2pcDNA3.1真核表达载体. 方法：应用体外基因拼装方法合成TFF2，然后TA克隆于pGMT easy载体中. 阳性克隆经测序鉴定. 再经双酶切消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1上，经酶切鉴定与测序证实. 结果：合成的TFF2经TA克隆后，筛选得到的阳性克隆,经测序鉴定，与设计的TFF2基因序列完全一致. 经酶切连接并成功插入pcDNA3.1上. 结论：成功构建了TFF2基因的真核表达载体,为以后的胃溃疡研究奠定了基础.

　　【关键词】 真核表达载体； TFF2基因;胃溃疡

　　0引言

　　某些生长因子的缺乏或者减少是消化性溃疡难以治愈的原因之一. 三叶因子2（Trefoil factor 2, TFF2）在生理条件时能保持胃黏膜完整与稳定，在急性损伤时分泌增多，在消化性溃疡中有特异表达，提示其在维持胃肠道黏膜的完整性和促进快速修复过程中起重要作用,在消化性溃疡的中有一定的应用前景. 我们用体外基因拼装技术合成TFF2，并构建该基因的真核表达载体.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　Taq酶.PCR凝胶回收试验盒和限制性内切酶为TaKaRa公司产品. 所有寡核苷酸和PCR引物片段均由上海博亚生物有限公司合成. pGEMT easy试剂盒购自Promega公司. 1 kb DNA ladder， Maker III，pfu PCR Master mix购自北京天为时代生物公司. pcDNA3.1 为我研究所保存. 其他试剂均为化学分析纯.

　　1.2方法

　　根据已知人的TFF2基因的蛋白序列（GeneBank登录号：NP_005414）来设计合成TFF2表达cDNA序列. 我们还在TFF2的信号肽和成熟TFF2之前，插入一段cmyc的标记(tag)，形成cmycTFF2. 为便于进一步的亚克隆，在cmycTFF2的氨基端添加BamH I酶切位点，在羧基端（即终止密码子之后）添加EcoR I和Xba I酶切位点. cmycTFF2最终设计序列约450 bp. 然后，按每40 bp的核苷酸的长度设计22条引物，有关［1］进行. 产物经电泳后，切取所需条带用PCR凝胶回收试验盒进一步纯化. 再用上下游两末端引物扩增35个循环后，加入25 mmol/L浓度的dATP 1 μL，72℃保温15 min. 取上述PCR终产物约3 μL，用pGMT easy试剂盒进行TA克隆. 方法按Promega公司提供的说明书进行. 克隆产物经EcoR I酶切鉴定后送博亚生物公司进行测序. 应用质粒小量提取试剂盒，提取测序正确的阳性克隆重组质粒经EcoR I和BamH I双酶切及琼脂糖凝胶电泳后，以柱式小量切胶回收试剂盒回收400 bp左右大小的电泳条带，质粒pcDNA3.1用相同的酶酶切后用乙醇沉淀法回收大片段，将回收的大小片段按1∶8的分子比用T4连接酶连接，用低温氯化钙法转化宿主E. coli DH 5α感受态细胞涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB培养基上用EcoR I和BamH I酶切鉴定［2］， 阳性克隆送博亚生物公司测序.

　　2结果

　　将按TFF2基因设计的40 bp的寡核苷酸混合，用pfu Master  mix进行拼装，结果发现，在第1次扩增时，电泳带呈拖尾状（smearing），并没有发现有明确的条带出现，但拼装的产物经稀释，再加入两端的引物进行第3次扩增时，可以见到所需的420 bp的条带（图1）. 在它的前后面有较弱的梯形带. 为进一步得到更纯的产物进行克隆，我们将产物纯化，再用未端引物进行PCR扩增，可见到一条非常清晰的目的基因带. 为进一步克隆，我们将PCR产物在Taq酶存在的条件下，进行未端加T. 然后，连接于pGMT easy载体. 将连接产物转化至大肠杆菌中，经蓝白斑筛

　　3讨论

　　三叶肽是一类较新的胃黏膜保护因子，成熟的TFF2是一个由106个氨基酸组成的蛋白质，我们利用PCR技术，在体外成功地拼装了TFF2基因. 这一技术是在以往同类研究的基础上进行改良的. 但与原方法相比，操作更为简单、方便和快捷. 我们采用的PCR拼装系统为pfu Master mix. 这省去了优化PCR系统的时间，并且由于pfu酶复制的真实性，可以真实地保持产物与设计的一致性. 在实验中，我们还采用了TA克隆的技术对产物进行克隆，而不是如原方法那样，首先在产物中设计好酶切位点，大量扩增产物后将产物纯化，然后进行酶切，再纯化后克隆，而是对产物直接进行克隆. 这大大减化了操作步骤并提高了效率. 另外，以前的方法中采用了pfu和Taq酶的复合物作为拼装体系，由于Taq酶缺乏纠错能力，有使产物出现突变的可能. 而我们在进行产物拼装和扩增时完全用pfu酶，因而，更高地保证了产物拼装的真实性.  我们将拼装的TFF2基因连接于pGMT easy载体，拼装的TFF2序列与设计序列完全一致. 又进行双酶切将TFF2切下来连接至pcDNA3.1上，经转化克隆，得到所需要的带有TFF2的真核表达载体. 经酶切鉴定及测序与设计TFF2序列完全一致.

　　【参考文献】

　　［1］ 陈学清，王亚东，孙勇，等. 体外拼装凋亡素基因［J］. 第一军医大学学报，2005，25（2）：195-197.

　　［2］ 王中华，窦科峰，杜建军，等. 人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达［J］.  第四军医大学学报, 2003,24（11）：968-971.