大鼠重型颅脑创伤后COX?2蛋白表达对学习记忆功能的影响

                                                                      作者：张涛 朱军 刘清军 李建民 付爱军

【摘要】  　　目的：观察大鼠重型颅脑创伤后COX?2的表达及选择性COX?2抑制剂NS?398对大鼠重型颅脑创伤后学习记忆功能的影响. 方法: 采用Marmarou?s方法建立大鼠重型闭合性颅脑创伤模型, 将成年Wistar大鼠360只随机分为脑创伤组、NS?398组、假手术组,每组又分为伤后1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168及336 h 10 个时相组,另取120只作为正常对照组. NS?398治疗组经致伤后, 给予腹腔注射NS?398 40 mg/(kg·d), 直至各时相点处死; 脑创伤组、假手术组及正常对照组在相同时间给予等量的生理盐水腹腔注射. 各组均在相应的时间点处死取材应用Western Blot方法及免疫组化法检测COX?2蛋白变化. 再取24只大鼠随机分为脑创伤组、NS?398治疗组、假手术组及正常对照组,进行水迷宫测试. 结果: NS?398能够使大鼠脑内COX?2蛋白表达高峰明显下调,使水迷宫测试的潜伏期明显缩短. 结论:提示COX?2与脑创伤后引发的继发性脑损伤密切相关， NS?398能够明显改善大鼠重型颅脑创伤后学习记忆障碍.

【关键词】  颅脑损伤 环氧合酶?2 抑制剂NS?398 Morris水迷宫 大鼠

      0引言

    颅脑损伤后的继发性因素是造成脑损伤发生、的重要原因，其中炎症是脑创伤病理生理过程中的一个重要组成环节. 环氧合酶?2（COX?2）是花生四烯酸代谢的限速酶,后者产生的前列腺素及血栓素是脑创伤后炎症级联反应的重要介质. 本实验我们应用Western Blot法，免疫组化法，观察应用选择性COX?2抑制剂NS?398后大鼠脑内COX?2蛋白表达变化及Morris水迷宫测试其对脑创伤后学习记忆的影响.

    1材料和方法

    1.1材料实验动物取480只健康成年雄性Wistar大鼠(河南医科大学实验动物中心提供. 动物合格证号为医动字第410117号), 体质量300～350 g, 随机分成脑创伤组, NS?398治疗组,假手术组及正常组，每组120只，分别用于Western Blot(60只)及免疫组化法(60只). 每组又分为伤后1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168及336 h 10个时相组. 另取24 只大鼠随机分为脑创伤组、NS?398治疗组、假手术组及正常对照组,每组6只，进行水迷宫测试.

    1.2方法

    1.2.1大鼠模型制备动物用100 mL/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,Marmarou?s方法［1］造成大鼠重型弥漫性颅脑创伤,致伤高度2 m,致伤物质量450 g. 伤后给予动物人工辅助呼吸及伤口清创缝合. 假手术组仅给予麻醉及头皮切开、缝合,但不致伤. 正常对照组不做任何处理.

    1.2.2给药NS?398纯标准品由美国Neuomarker公司提供, NS?398治疗组于伤后即刻给于(40 mg/ kg)腹腔内注射一次，以后给药1次/d, 直至各时相点处死,同时脑创伤组、假手术组及正常对照组给于等量的生理盐水腹腔注射.

    1.2.3免疫组化检测于上述伤后各时相点,对动物用100 mL/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，开胸, 40 g/L多聚甲醛经心灌流固定10 min后,取出脑组织,置于40 g/L多聚甲醛后固定12～24 h (4℃). 取出固定液中脑组织标本,常规脱水、石蜡包埋. 冠状面连续切片,厚度约4 μm,经黏片剂处理过的载玻片捞片,置于60℃烤箱烘烤1 h后, 严格按试剂盒说明操作,一抗为兔抗鼠COX?2 mAb（天津灏阳生物技术有限公司提供）. 每次实验均设阴性对照,以PBS代替一抗. 胞质有棕褐色颗粒者为COX?2阳性细胞.

    1.2.4Western Blot技术检测蛋白质的表达动物断头后1 min内小心取出新鲜脑组织，经不同处理后,置于4℃预冷细胞裂解液中, 低温离心后,保留上清, 采用考马斯亮蓝（CBB）G250蛋白定量法［2］测定蛋白质浓度. 等量蛋白质在120 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳后,转移蛋白质至硝酸纤维素膜上, 用50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h, 用鼠mAb COX?2抗体(1∶100)在10 g/L的脱脂奶粉中4℃过夜. 再加入封闭液稀释的二抗(稀释度1∶500)室温1 h; DAB显色: TBST漂洗液漂洗3次，每次20 min于脱色摇床上，加入双蒸水10倍稀释的DAB显色约10 min，见有清晰条带出现即用PBS终止显色,扫描并以CMIAS真彩色医学图像分析系统软件进行定量分析.

    1.2.5Morris水迷宫测试严格按照Smith等［3］的方法,取24只大鼠随机分为脑创伤组、NS?398治疗组、假手术组及正常对照组,于伤后7, 8, 9, 10 d进行学习记忆功能测试.

    统计学处理: 实验数据用x±s表示，使用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD?t检验. P<0.05为有统计学意义.

    2结果

    2.1免疫组化正常对照组及假手术组，大鼠海马CA3区及皮层偶见COX?2阳性细胞，胞质着色浅淡，阳性细胞以神经元为主. 伤后3 h海马CA3区及皮层COX?2蛋白表达呈增强趋势；伤后24 h海马CA3区COX?2蛋白表达达峰值； 48 h表达略有下降，而皮层COX?2蛋白于伤后48 h表达达峰值； 72 h表达开始下降，至14 d天海马CA3区及皮层COX?2蛋白表达仍高于正常值(表1，2, 图1，2), NS?398组显示自伤后6 h起海马CA3区及皮层COX?2蛋白同创伤组相应时相点免疫反应相比明显减轻，且具有显著性差异(P<0.05, 图3，4).表1各组COX?2蛋白在海马CA3区灰度值表达量表2各组COX?2蛋白在皮层灰度值表达量

    2.2COX?2  Western Blot于Mr为70×103左右见COX?2棕色条带，结果用平均灰度值表示. 结果提示，伤后6 h即出现COX?2蛋白表达增强； 创伤组各条带密度值逐渐加深,至伤后48 h COX?2表达达峰值， 与假手术组比较极有显著性差异(P<0.01)； 随图1脑创伤后24 h海马CA3区COX?2的表达×200

    2.3Morris水迷宫测试创伤组伤后第9日（P<0.01）及第10日（P<0.01）搜索安全岛潜伏期较正常组及假手术组明显延长, NS?398治疗组较创伤组明显缩短(表4).

    3讨论

    研究表明COX?2在炎症反应中发挥重要作用,是炎症反应介导的细胞毒性重要的决定因素之一［4］.探讨COX?2在脑创伤后引起细胞损伤的机制,不得不提到中枢神经系统中存在的一种很重要的兴奋性受体?谷氨酸受体，COX?2反应产物PGE2可增强表4各组Morris水迷宫测试搜索安全岛潜伏期离子型谷氨酸受体N? 甲基? D天冬氨酸介导的神经毒性作用，引起脑损伤［5］. 另外，COX?2是花生四烯酸代谢的必需酶，其代谢产物前列腺素和血栓素A2(TXA2)产生增加，其中TXA2是目前已知最强的一种血管收缩因子，并且TXA2和前列腺素具有趋化性,可导致血小板和中性粒细胞黏附于血管内皮细胞，从而加重伤后脑缺血，引起血管通透性变化，神经细胞水肿，加重神经元损伤. 其次，COX?2作为前列腺素合成酶,催化PGG2转变为PGH2时生成大量的氧自由基,众所周知,超氧离子能直接参与脑组织的损伤,或与NO形成氧化能力更强的过氧亚硝基, 引起脑组织损伤和细胞凋亡. 这类氧化损伤在脑创伤后继发炎症反应引发的细胞毒性中起了重要作用. 并且，近年来研究表明，脑损伤后COX?2与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在相同的时间点于相临近的细胞内表达，并且NO可增强COX?2的催化活性，增强氧自由基和毒性PG的合成，而COX?2的催化产物氧自由基又可促进NO毒性作用，两者相互作用引起脑损伤［6］. 以上种种机制均可引发损伤原发部位周围的神经细胞结构及功能破坏，导致继发性神经细胞死亡，神经元丢失,从而影响学习记忆功能的恢复. 并且，在缺血性脑损伤实验中已发现过度表达COX?2的转基因小鼠产生明显的兴奋毒性［7］,而COX?2基因敲除的小鼠脑缺血后的梗死体积显著缩小. 本实验应用Western Blot技术，免疫组化法观察到大鼠脑创伤后脑中COX?2蛋白表达增多，且有性表达，这和Cernak等［8］通过复制大鼠弥漫性脑损伤模型中COX?2蛋白表达的规律研究大致基本相似. 并发现经NS?398治疗后大鼠脑中COX?2蛋白表达明显减少，且能显著改善脑创伤后大鼠学习记忆功能，是大鼠脑创伤后治疗的有效药物. 考虑NS?398的保护作用可能主要与减少花生四烯酸环氧酶途径代谢产物有关. 但NS?398其他方面的机制, 如: 减少氧化损伤、 抑制促炎细胞因子的产生及细胞凋亡等,是否也参与了脑创伤后的保护作用将有待于进一步深入研究.

    总之，COX?2作为前列腺素合成的一个重要的限速酶，如此持续高水平表达可能是由于氧化损害造成神经细胞的持续损伤，前列腺素受体的介导，或是这些因素的共同作用所导致的基因表达水平的改变，这可能是造成继发性脑损伤，促进神经病理的进展，加重行为改变的根本原因. 故进一步研究COX?2对神经细胞的确切作用机制以及COX?2选择性抑制剂保护机制，从而为临床上治疗创伤性脑损伤等神经系统疾病提供新的途径.

【】
  ［1］ Marmarou A, Foda MA, van den Brink W, et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics［J ］. J Neurosurg, 1994, 80(2): 291-300.

［2］ 温进坤, 韩梅. 医学分子生物学理论与研究技术［M］. 2版. 北京: 出版社，2002: 217-221.

［3］ Smith DH, Okiyama K, Thomas MJ, et al. Evaluation of memory dysfunction following experimental brain injury using the Morris water maze［J］. J Neurotrauma,1991, 8(4): 259-269.

［4］ Feng L, Sun W, Xia Y, et al. Cloning two isoforms of rat cyclooxygenase: Differential regulation of their expression［J］. Arch Biochem Biophys, 1993, 307(2): 361-368.

［5］ Iadecola C, Niwa K, Nogawa S, et al. Reduced susceptibility to ischemic brain injury and N?methyl ?D?aspartate?mediated neurotoxicity in cyclooxygenase?2?deficient mice［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(3):1294-1299.

［6］ Kim SS, Kong PJ, Kim BS, et al. Inhibitory action of minocycline on lipopolysaccharide?induced release of nitric oxide and prostaglandin E2 in BV2 microglial cells［J］. Arch Pharm Res, 2004, 27(3):314- 318.

［7］ Kelley KA, Ho L, Winger D, et al. Potentiation of excitotoxicity in transgenic mice overexpressing neuronal cyclooxygenase?2［J］. Am J Pathol, 1999, 155(3): 995-1004.

［8］ Cernak I, O?Connor C, Vink R. Inhibition of cyclooxygenase 2 by nimesulide improves cognitive outcome more than motor outcome following diffuse traumatic brain injury in rats［J］. Exp Brain Res, 2002,147(2):193-199.