化学去细胞同种异体神经制备的改良及桥接周围神经缺损效果

                                                 作者：王冠军 卢世璧 孙明学 许文静 张莉 郭全义 彭江 赵斌

【摘要】  　　目的：改良去细胞异体神经的制备方法，研制出一种理想的自体神经移植替代物. 方法：将用Sondell法（Triton X?100、脱氧胆酸钠）和改良法［Triton X?200，sulfobetaine?10（SB?10）,sulfobetaine?16（SB?16）］两种方法制备的去细胞异体神经用HE染色、髓鞘染色、免疫组化染色、扫描电镜检查等进行组织学评价. 然后将制备的神经桥接大鼠坐骨神经缺损，从坐骨神经指数、神经电生理、运动终板染色等方面评价神经移植后的再生效果. 结果：改良法制备的神经细胞及髓鞘去除彻底、结构保存完好；移植后神经再生良好，优于Sondell法制备的神经，达到了与自体神经移植相当的再生效果. 结论：综合运用萃取剂Triton X?200,SB?10和SB?16的改良化学萃取方法是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，其制备的异体神经移植物可望替代自体神经移植.

【关键词】  周围神经 化学萃取 去细胞异体神经 神经再生 神经缺损

     0引言

    周围神经缺损的修复是临床上的难题，目前主要采用自体神经移植修复，但此方法有诸多缺点，且常因供体有限，无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要［1］. 异体神经来源广泛，但新鲜异体神经移植会出现导致移植失败的免疫排斥反应. 采用化学萃取方法能较好地降低异体神经的免疫反应［2-3］，但由于处理方法的不同，有时对神经的结构破坏太大［2］. 本研究旨在改良去细胞异体神经的制备方法，即综合应用萃取剂Triton X?200，sulfobetaine?10（SB?10）和sulfobetaine?16（SB?16），并与目前得到认可的Sondell化学制备方法（应用萃取剂Triton X?100和脱氧胆酸钠）进行比较；并将改良制备的异体神经桥接周围神经缺损，评价其再生效果，以期研制出一种理想的自体神经移植替代物.

    1材料和方法

    1.1材料健康成年SD大鼠26只，雌雄不拘，体质量270～300 g，用于去细胞异体神经制备. 健康成年Wistar大鼠24只，雌雄不拘,体质量300～320 g，用于神经移植动物实验. 上述动物由解放军总动物中心提供. 回旋式恒温振荡器(上海跃进医疗仪器厂)；环境扫描电镜（QUANTA 400，清华大学）；显微外科器械，手术显微镜，便携式肌电图仪（Medtronic Keypoint，丹麦）；TritonX 100，脱氧胆酸钠，Triton X 200 ，SB?10，SB?16(美国Sigma公司).

    1.2方法

    1.2.1去细胞异体神经制备将SD大鼠26只用100 g/L水合氯醛以0.4 μL/g腹腔注射麻醉后,切取双侧全长坐骨神经，每根神经长约20 mm. 分3组进行处理：Sondell法组（10只）、改良法组（10只）和对照组（6只）. Sondell法处理步骤为：①蒸馏水中振荡浸浴12 h；② 30 g/L Triton X?100溶液中振荡萃取12 h；③ 40 g/L脱氧胆酸钠溶液中振荡萃取24 h；④重复上述步骤1次；⑤蒸馏水冲洗30 min. 改良法处理步骤为：①蒸馏水中振荡浸浴12 h；②125 mmol/L SB?10溶液中振荡萃取12 h；③1.4 g/L Triton X?200和0.6 mmol/L SB?16溶液中振荡萃取24 h；④重复上述步骤1次；⑤ 0.01 mmol/L PBS（pH 7.2,下同）冲洗30 min. 处理后的神经于4℃的PBS液中储存备用. 对照组神经不作化学处理.

    1.2.2移植手术将Wistar大鼠随机分成3组，每组8只. Sondell法组用Sondell法制备的异体神经移植；改良法组用改良法制备的异体神经移植；对照组用自体神经移植. 造成坐骨神经10 mm长缺损，手术显微镜下将移植物用8?0无损伤尼龙线与断端吻合. 对照组将自体神经近、远端翻转后吻合.

    1.2.3去细胞异体神经质量评价光镜观察：常规石蜡包埋, 5 μm的横向和纵向组织学切片. HE染色,观察去细胞程度和围绕神经轴突的基底膜管结构的完整性；快蓝(fast blue)染色,观察髓鞘残留成分；基底膜素（laminin）免疫组化染色，观察基底膜素的保留. 电镜观察：于20 g/L OsO4溶液中固定24 h后，二甲胂酸钠缓冲液冲洗，滤纸蘸干水分，投入液氮中冷冻，取出后迅速切成5 mm小段，于冷冻干燥机中干燥固定，环境扫描电镜下观察基底膜管结构的完整性及去髓鞘程度. 综合质量评分：根据我们制定的评分标准［4］，由病理专业人员按去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性观察的标准，行双盲观察计分，综合评分，分数越低，表示制备的质量越好.

    1.2.4神经再生效果观察术后即行大体观察；术后3 mo行坐骨神经功能指数(SFI)测定；SFI测定后将动物在麻醉状态下用肌电图仪行运动诱发电位检测；继之将动物大剂量麻醉（100 g/L水合氯醛，0.8 μL/g）处死，行运动终板病理染色. 一般观察：对实验动物进行肢体功能恢复以及术后并发症发生情况的观察. 坐骨神经功能指数测定：自制木箱，将白纸置于箱底. 大鼠双足醮碳素墨水，经过木箱后留下足印. 选实验侧足(E)、正常侧足(N)足印测量3个变量： PL(足印长度)，TS(足趾宽度)，TI(中间足趾距离)，精确到mm. 将测量值代入Bain公式得出SFI值. 用运动神经传导速度检查观察跨过移植段神经的上下两刺激点在出现运动诱发电位时限上的差别. 靶肌肉运动终板染色：切取坐骨神经支配区的小腿三头肌肌腹部位的纤维，用胆碱酯酶法进行运动终板染色，观察靶肌肉中运动终板的再生情况.

   统计学处理：应用SPSS 11.5统计分析软件进行数据处理，数据以x±s表示. 组间对比用成组资料或配对资料的t检验，P<0.05时，有显著性差异.

    2结果

    2.1去细胞异体神经制备组织学评价HE染色示Sondell法组与改良法组中均见不到任何细胞，红染的神经内膜呈波浪状纵形排列. Sondell法组于红染的神经内膜之间出现了大的空隙；而改良法组排列均匀一致，均未出现大的空隙（图1）. 快蓝染色示Sondell法组与改良法组中均显示细胞完全消失、髓鞘大部分消失. Sondell法组残留的髓鞘染色较重，改良法组较轻. 基底膜素免疫组化染色示Sondell法组与改良法组中均可见到大部分黄染的基底膜素的保留. Sondell法组中保留基底膜素染色较轻，改良法组较重. 环境扫描电镜(EM)观察示Sondell法与改良法制备的去细胞异体神经均可见到基底膜保留，管腔扩大. Sondell法制备的去细胞异体神经可见到较多的空腔管壁不完整，相互融合连成大的空腔. 改良法中小空腔排列规范，管壁破坏的较少，较少见到融合的大空腔(图2). 综合质量评分： 经配对资料t检验，  t1=0.542，P1=0.611＞0.05； t2=3.162，P2=0.025<0.05； t3=2.712，P3=0.042＜0.05； t4=3.344， P4=0.004＜0.05. 其中， t1，t2，t3，t4分别指Sondell法组与改良法组间在去细胞程度、髓鞘染色分级、结构完整性以及综合质量评分的统计量.

    2．2移植后神经再生效果评价

    2.2.1大体观察术后3 wk时,大鼠术肢出现足部皮肤红肿或不同程度的溃疡，约6 wk后皮肤红肿及溃疡基本消退，各组无明显差异. SFI测量：术后3 mo，自体神经移植组为-40.81±7.38；sondell法组为-71.25±7.44；改良法组为-46.53±6.81，经成组资料t检验，sondell法与改良法：t1=6.2165, P1=0.0008＜0.05，有统计学差异，改良法优于sondell法. 改良法与自体移植：t2=1.4487, P2=0.1976＞0.05，无统计学差异，改良法与自体效果相似. Sondell法与自体移植：t3=5.8095, P3=0.0011＜0.05，有统计学差异，sondell法差于自体移植.A: Sondell法组，去细胞完全，神经结构破坏较重; B: 改良法组，去细胞完全，神经结构破坏较轻.

    2.2.2肌电图检测术后3 mo时, sondell法组的运动神经传导速度为39.7±3.6，改良法组为43.5±3.4， 自体移植组为49.8±4.1. 经成组资料t检验，sondell法与改良法：t1=2.1705, P1 =0.0477＜0.05，有统计学差异，改良法优于sondell法. 改良法与自体移植：t2=3.3455, P2=0.0048＜0.05，有统计学差异，改良法差于自体移植（图3）.

     2.2.3运动终板染色各组运动终板与正常相比均较小，染成浅棕色，未能恢复至正常形态. 高倍镜下运动终板计数，sondell法组为14±3，改良法组为19±3，自体移植组为22±4. 经成组资料t检验，sondell法与改良法：t1=3.3333, P1=0.0049＜0.05，有统计学差异，改良法优于sondell法. 改良法与自体移植：t2=1.6971, P2=0.1118＞0.05，无统计学差异，改良法与自体效果相似. Sondell法与自体移植：t3=4.5255, P3=0.0005＜0.05，有统计学差异，sondell法差于自体移植.

    3讨论

    神经同种异体移植的抗原性主要存在于施旺细胞和髓鞘. 为降低同种异体神经的抗原性，人们尝试采用了多种方法对同种异体神经移植进行预处理，如低温保存、冻融、冷冻干燥、冷冻放射和化学萃取等［5］. 冻融法虽然能杀死细胞，去除免疫原性，但不能清除细胞碎片，且常常引起基底膜碎裂. 放射法虽不会引起组织形态的破坏，同时也能杀死细胞，去除免疫原性，但同冻融法一样不能清除细胞碎片. 化学萃取法能杀死细胞，降低免疫反应，同时清除大部分细胞碎片，但如果萃取剂的选择不当，不但影响免疫原物质的去除，且易引起神经形态结构的破坏［6］. 目前得到认可的化学萃取方法有Sondell方案，但此法仍有许多不尽意之处，由于其在一定程度上破坏了神经基底膜管及细胞外基质结构，故影响了轴突的再生［7］. 而基底膜管及细胞外基质在轴突再生的过程中起重要作用［8］.

　　我们的实验结果表明，在去细胞神经制备组织学评价方面， HE染色示两种方法的去细胞效果均较好，但改良法对神经结构的破坏较小；快蓝染色表明，改良法对髓鞘的去除较为彻底；基底膜素免疫组化染色表明，改良法对基底膜素的保留略好于Sondell法；环境扫描电镜表明，改良法对神经结构的保存略好于Sondell法；综合质量评分结果表明，两种方法在去细胞效果方面相当，但在髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法，综合去细胞程度、髓鞘染色分级、结构完整性三方面质量评分，改良法优于Sondell法. 在神经移植后再生效果评价方面，SFI测量表明改良法优于sondell法，达到了与自体神经移植相当的效果. 肌电图检测表明，改良法制备的神经移植运动神经传导速度快于Sondell，但较自体神经移植慢. 运动终板染色结果表明，改良法制备的神经移植再生的运动终板多于Sondell法，达到了与自体神经移植相当的效果，但均未达到正常运动终板形态.

　　综上所述，在去细胞神经制备组织学评价方面及体内动物实验神经移植后再生效果评价方面，改良法均优于目前得到认可的Sondell法制备方法. 因此，综合运用萃取剂Triton X?200,SB?10和SB?16的改良化学萃取方法，是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，其制备的异体神经移植物可望替代自体神经移植.

【】
  ［1］ Rovak JM, Bishop DK, Boxer LK, et al. Peripheral nerve transplantation: The role of chemical acellularization in eliminating allograft antigenicity［J］. J Reconstr Microsurg, 2005, 21(3):207-213.

［2］ 孙明学，唐金树，王鑫，等. 去细胞处理对化学去细胞异体神经免疫原性的影响［J］. 中华外科杂志, 2006,44(4):275-278.

［3］ 衷鸿宾，卢巨璧，侯树勋，等. 人类去细胞同种异体神经移植物化学萃取方法的研究［J］. 中华外科杂志, 2003, 41(1):60-63.

［4］ Sun MX, Lu SB, Tang JS. Experimental study on repairing different length nerve defects with chemical extracted acellular nerve allograft ［J］. Chin J Orthop, 2006, 14（8）: 603-607.

［5］ Sun MX, Tang JS, Xu WJ. Experimental study on chemical extracted acellular nerve allograft ［J］. Chin J Orthop, 2006, 26(4): 267-271.

［6］ Hudson TW, Liu SY, Schmidt CE. Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing［J］. Tissue Eng, 2004，10(9?10):1346-1358.

［7］ Hudson TW, Zawko S, Deister C, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration［J］. Tissue Eng, 2004，10(11?12):1641-1651.

［8］ Dubovy P, Svizenska I, Klusakova I, et al. Laminin molecules in freeze?treated nerve segments are associated with migrating Schwann cells that display the corresponding α6β1 integrin receptor［J］. Glia, 2001, 33(1):36-44.