低浓度α?生育酚对神经元细胞膜的保护作用
【摘要】 目的: 探讨低浓度α?生育酚对神经元细胞膜的保护作用. 方法: 培养SD胎鼠皮层神经元细胞作为实验对象. 将神经元细胞进行分组：正常对照组、氧自由基损伤组和不同浓度α?生育酚处理组(10，20，40和80 mg/L). 用Fenton反应对神经元细胞膜造成损伤. 在损伤后1及2 h分别对各组神经元进行PI染色，利用激光共聚焦显微镜观察神经元细胞膜的损伤情况，并用TBA法检测神经元细胞外液中丙二醛(MDA)生成量. 结果: 80 mg/L浓度α?生育酚可减少氧自由基对神经元细胞膜的损伤, 且可减少MDA生成量. 结论: 80 mg/L浓度α?生育酚可以有效对抗氧自由基对神经元细胞膜的损伤.
【关键词】 α?生育酚 神经元 细胞膜 低浓度
0引言
氧自由基是引起颅脑损伤等多种中枢神经疾病继发损伤的重要因素. 而维生素E是一种天然的抗氧自由基物质. 维生素E共包括8种分子，其中α?生育酚为公认抗氧自由基最有效的［1］. 在近年的研究中，已证实α?生育酚可阻止氧自由基对细胞膜中多不饱和脂肪酸及膜蛋白的攻击，防止细胞膜功能的丧失［2］. 然而国内外学者对应用多大浓度的α?生育酚才可有效保护细胞膜有很大分歧. 本实验我们利用Fenton反应形成氧自由基对胚胎大鼠皮层神经元的损伤，观察低浓度α?生育酚对神经元细胞膜的保护作用.
1材料和方法
1.1材料α?生育酚、碘化吡啶（PI）染料（Sigma公司，美国）；2.5 g/L胰蛋白酶、0.2 mol/L EDTA、各种细胞培养液（GibcoBRL公司，美国）；MDA检测盒，购于南京建成生物公司；300 mL/L双氧水，硫酸亚铁，维生素C和无水乙醇，均为国产分析纯. 孕14 d的SD大鼠2只，购自人民解放军军事医学院实验动物中心. TE200?E型激光共聚焦显微镜观察( NIKON公司, 日本)；TG?150型二氧化碳培养箱(Jouan公司,法国)；CR?22G型离心机（日立公司，日本）；UV240型紫外分光光度计（岛津公司，日本）.
1.2方法
1.2.1α?生育酚水溶液配制取α?生育酚10 mg溶于1 mL无水乙醇中，将无水乙醇缓慢滴入49 mL 30℃去离子水中，制成200 mg/L α?生育酚水溶液母液备用. 碘化吡啶染料配制：将碘化吡啶粉末以去离子水溶解为终浓度为1 mg/L工作液.
1.2.2SD大鼠皮层神经元分离及培养将实验大鼠断颈处死，取胚胎脑皮层组织，剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 mmol/L EDTA，令其分散成单细胞悬液，过200目不锈钢网,于37℃, 50 mL/L CO2培养箱中进行培养. 隔日换液. 培养到第4日，细胞悬液于离心机中以1000 r/min速度离心10 min，去沉淀细胞，加入神经元培养液，接种于涂有鼠尾胶原的25 cm×25 cm细胞培养瓶中，使干细胞转化为神经元，隔天换药一次，第6日使用.
1.2.3实验分组将所有神经元培养瓶进行分组，共分为：正常对照组；氧自由基损伤组；不同浓度α?生育酚处理组（10, 20, 40和80 mg/L亚组，与神经元作用1 h后备用）.
1.2.4利用Fenton反应造成神经元氧自由基损伤按照Yamazaki等［3］方法，在培养皿中加入硫酸亚铁、维生素C和300 mL/L双氧水，使溶液中硫酸亚铁终浓度为0.2 mmol/L,维生素C终浓度为0.2 mmol/L，双氧水终浓度为0.4 mmol/L，制作氧自由基损伤模型.
1.2.5PI染色按照袁兰等［4］方法，将PI粉末以去离子水溶解为终浓度1 mg/L工作液. 将氧自由基损伤组及α?生育酚处理组及正常组培养瓶中加入试剂后，立即开始计时，并取反应开始后1和2 h培养瓶中的神经元进行PI染色，将PI工作液100 μL均匀滴在神经元细胞上，置于暗室中染色15 min，用pH 7.0 PBS液冲洗3遍.
1.2.6激光共聚焦显微镜观察细胞形态激光共聚焦显微镜荧光激发波长为567 nm，发射光波长大于590 nm，伪彩色采用红色，在保证信噪比的情况下尽量增大检测的pinhole和PMT. 选定5个图像清晰的视野，在200倍镜下观察. 细胞红染者为细胞膜损伤细胞，未染色者为正常细胞［4］. 每个视野随机计数100个神经元，记录其中有细胞膜损伤的神经元数，共记录5个视野内神经元，平均值.
1.2.7MDA测定采用MDA检测盒，结合紫外分光光度计，按照TBA法分别检测各组神经元培养瓶中溶液的MDA浓度. 每一次取0.1 mL溶液检测，每瓶测值为该瓶溶液的MDA浓度.
统计学处理：所有数据以x±s表示，多个样本间均数比较用方差分析，用Student?Newman?Keuls(SNK)法进行多组间两两比较. P<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1神经元细胞膜损伤分析正常对照组只有极少荧光染色阳性细胞，而损伤组和α?生育酚处理组均有荧光染色阳性细胞（图1,2）. α?生育酚浓度为正常生理浓度10 mg/L时，不能有效消除Fenton反应所造成的氧自由基损伤. 而当α?生育酚达到80 mg/L时，细胞膜损伤的神经元总数减少，有统计学意义.
2.2MDA结果分析80 mg/L α?生育酚处理组MDA产生量低于单纯氧自由基损伤组（表2），但仍高于正常对照组.表1碘化吡啶染色结果比较表2不同处理组的MDA值比较
3讨论
氧自由基对于细胞膜有很多的损害［5］,所以，抗氧自由基是减少颅脑损伤等病理状况下神经元损伤的重要手段.
α?生育酚与氧自由基反应后，生成α?生育醌，减少氧自由基与其他分子反应［2］. α?生育酚为脂溶性，血浆浓度为5~10 mg/L. 在细胞膜中，维生素E与不饱和脂肪酸的比例为1∶1000，可以有效地消除正常生理状况产生的氧自由基对细胞膜的损伤. 在病理情况下，氧自由基大量产生，5 min内即可使血浆内的α?生育酚浓度大幅下降，不能有效的对抗氧自由基的损伤［6］. 因此，早期补充α?生育酚减少氧自由基对细胞的损伤，成为人们较感兴趣的治疗策略.
De Jesus Ferreira等［7］主张保护细胞膜的α?生育酚浓度应达到1 g/L，才能有效对抗氧自由基的破坏作用. Sperling等［8］ 甚至提出可用100 g/L浓度的α?生育酚进行神经元保护是可行的方案. 贾丽红等［9］在对神经胶质细胞试验中，认为50 mg/L α?生育酚即可起到抗氧化的保护作用. 而国内尚少有低浓度α?生育酚对神经元保护作用的报道. 从本试验可以看出，正常血浆浓度8~10倍的α?生育酚即可产生较为明显的神经元细胞膜保护作用,细胞膜脂质多不饱和脂肪酸氧化产物MDA也小于单纯氧自由基损伤组. 而且，80 mg/L α?生育酚组在损伤后2 h存在细胞膜损伤的神经元为（41.5±5.9）个，少于损伤后1 h存在细胞膜损害的神经元（66.0±7.3）个. 这种现象是否意味着α?生育酚可促使损伤细胞膜发生自我修复改变，尚需深入研究. 低浓度α?生育酚的治疗作用对于临床应用较有意义. 因为现今应用α?生育酚进行动物试验，多采用口服及腹腔注射两种方法. 而生物体内的α?生育酚主要存在于肝脏，不能自由穿过血脑屏障，所以这两种方法均不能使脑组织中的α?生育酚浓度达到很高浓度. Naziroglu等［10］采用口服800 mg，仅能使血浆中α?生育酚达到21 mg/L，腹腔注射160 mg/kg α?生育酚后，血浆中α?生育酚可达到类似结果. Cherdyntseva等［11］在研究中发现，给与SD大鼠标准腹腔注射量α?生育酚（600 mg/kg）每天进行腹腔注射，只能使血浆中α?生育酚浓度达到80 mg/L. 高浓度的α?生育酚在以往的实验中显示可以使氧自由基对神经元损伤减少到较低的程度［8-9］. 但在当今条件下，临床无法达到使脑组织和血浆中α?生育酚达到至1 g/L的水平，而且，如此高浓度的α?生育酚在脑组织中是否会引起不良反应尚无定论. 相反，在颅脑损伤等情况下，血脑屏障受到损伤，则可很容易地使伤区脑组织中α?生育酚浓度达到接近80 mg/L的水平，从而达到治疗目的. 这使临床应用α?生育酚治疗颅脑损伤等神经系统疾病成为可能.
【】
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