限制运动对大鼠股骨、胫骨物理性状、生物力学指标及骨形成蛋白2表达的影响

【摘要】  　　目的：本研究比较了限制运动4 wk大鼠和正常对照组大鼠下肢股骨、胫骨物理性状包括湿质量，灰质量，骨矿含量，骨密度，生物力学指标以及骨形成蛋白2表达量的变化，目的在于找出限制运动对大鼠下肢骨生长有哪些不良影响. 方法：采用腿?尾固定法制造大鼠限制运动的模型，用DPX双能X线骨密度仪测量大鼠左侧下肢骨骨矿含量和骨密度，用WD万能材料试验机进行股骨3点弯曲试验，测算出股骨的破坏强度，破坏载荷，破坏时能量吸收和刚度系数等生物力学指标，采用免疫组化染色及灰度比较的方法比较骨形成蛋白2表达的变化. 结果：限制运动4 wk后，大鼠股骨、胫骨的湿质量，灰质量，骨矿含量，骨密度，生物力学指标与正常对照组比较存在下降，并且与骨形成密切相关的骨形成蛋白2的表达也下降. 结论：限制运动对大鼠下肢骨（股骨、胫骨）的生长产生了负面影响，表现在下肢骨物理性状的变化及骨形成蛋白表达的抑制等方面.

【关键词】  运动 股骨 胫骨 骨形成蛋白2

      0引言

    人体骨骼的发育和生长受到很多因素的影响， 运动是影响骨骼后天生长和重塑的重要因素，力学信号作用于细胞骨架，使细胞骨架发生改变，激活特定的信号传导途径，引起基因表达调控的改变，从而影响成骨细胞的生长和分化，也就影响了骨骼的生长、修复和塑型［1-5］. 骨形成蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)是成骨细胞分泌的一种局部分化因子，能诱导成骨细胞的前体细胞分化为成骨细胞，在成骨细胞分化早期有重要作用，它介导糖皮质激素诱导的成骨细胞分化，是诱导成骨的重要因子［6］. 本研究通过固定大鼠后肢4 wk，比较限制运动后大鼠后肢骨物理性状如湿质量，灰质量，骨矿含量(bone mineral content, BMC)，骨密度(bone mineral  density, BMD)，生物力学指标以及对BMP2表达量的变化，来探讨限制运动对大鼠后肢骨生长的影响.

    1材料和方法

    1.1材料选用32只雄性上海实验动物中心引进的清洁级SD大鼠，体质量270～290 g.

    1.2方法

    1.2.1制备实验动物模型将大鼠随机分为对照组、固定组两组，每组16只. 固定组大鼠在100 g/L水合氯醛腹腔麻醉下，将左侧后肢和尾部近段消毒铺巾，以消毒后的直径为1.2 mm的医用钢丝穿过后肢踝部和肛门开口远侧约1.0～2.0 cm处之尾部，松紧适当地打节固定，如有出血则压迫止血, 术毕置于大鼠专用饲养笼，隔日以碘伏消毒固定局部. 对照组大鼠未做任何处理. 实验期间给于充足的清洁饮水、摄食（饲料为第四军医大学实验动物中心提供的标准鼠饲料）. 室温保持在（22±2）℃，人工控制室内照明，保持12 h光照（8:00~20:00），12 h黑暗（20:00～次日8:00）交替循环.

    1.2.2观察一般情况及体质量测量实验期间密切观察大鼠生活情况（包括饮食，饮水，活动情况，皮毛色泽等），实验开始时测量大鼠体质量，以后每周测量大鼠体质量，直至4 wk实验结束. 所用设备为ACA?100型天平.

    1.2.3物理性状测定实验结束后断头处死大鼠，分别从两组各取8只大鼠的左侧股骨、胫骨，去净附着的结缔组织后测量其物理性状，包括湿质量，灰质量，BMD，生物力学指标等. 湿质量采用ACA?100型电子天平测量；灰质量是标本在118℃烘烤48 h,至恒质量后放在箱式电阻炉中,800℃放置24 h后用TMP?1上皿式天平（精度1×10-3 g）测量；股骨和胫骨BMC和BMD用DPX双能X线骨密度仪（美国Lunar公司）测量,分别精确至0.01 g和0.01 g/cm2.

    1.2.4生物力学指标测定取测量BMD后的左侧股骨用WD万能材料试验机（广州试验仪器厂）进行股骨3点弯曲试验，试件跨度18~22 mm，加载速度1 mm/min. 测算出股骨的破坏强度，破坏载荷，破坏时能量吸收和刚度系数等生物力学指标.

    1.2.5免疫组化染色及观察取两组剩余8只大鼠左侧股骨、胫骨去除结缔组织，纵剖面从中线切开，40 g/L多聚甲醛固定24 h，4℃脱钙液（200 g/L的甲酸∶200 g/L的柠檬酸钠=1∶1）脱钙10 d，至脱钙完全，室温逐级乙醇脱水，氯仿透明，低熔点（53~54℃）石蜡包埋、切片，厚度为6 μm. 免疫组化采用SA2010型试剂盒，按SABC法进行染色，BMP2抗体按1∶50进行稀释. 操作过程严格按照试剂盒说明进行. 最后用DAB呈色，苏木精衬染，常规封片观察. 阳性产物为棕黄色片状或颗粒状染色. 在做图像灰度分析时，所取视野股骨均为干骺端骨髓与骨质的交界处，胫骨均为胫骨近膝关节段骨干与骨髓交界处，记录其图像的灰度值.

    统计学处理： 所得数据均以x±s表示， 固定组与对照组比较采用SPSS 7.0统计软件进行t检验， P<0.05认为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1两组大鼠体质量的差异固定组与对照组大鼠在实验期间体质量均有所增加，实验前固定组大鼠的体质量为：(282±12) g，对照组为：(279±12) g, 4 wk后固定组大鼠体质量为：(395±16) g, 对照组为：(391±16) g. 经统计学处理两组体质量无统计学差异.

    2.2两组大鼠股骨及胫骨物理性状的改变与对照组相比较固定组大鼠的胫骨及股骨的湿质量，灰质量，BMC，BMD均有统计学差异(表1，2).表1两组大鼠股骨（左侧）物理性状的比较表2两组大鼠胫骨（左侧）物理性状的比较

    2.3两组大鼠股骨生物力学指标的改变与对照组相比较固定组大鼠的股骨在各项生物力学指标均有统计学差异(表3). 表3两组大鼠股骨（左侧）生物力学指标的比较

    2.4BMP2免疫组化染色经检验，固定组大鼠的股骨，胫骨的平均灰度值小于对照组大鼠(P<0.05, 表4). 表4两组大鼠股骨、胫骨（左侧）BMP2抗体免疫组化染色灰度值的比较镜下观察显示对照组股骨和胫骨骨皮质可见部分阳性着色区；而在干骺端可见着色的大量软骨、成骨细胞；在骨髓腔呈强染色，可见很多的棕黄色阳性着色区. 固定组与对照组的着色特征是一致的，只是着色部位的数量及着色强度有所不同(图1,2).

      3讨论

    在骨骼的生长和发育过程中，力学因素是一个非常重要的因素，运动对未成年骨骼的影响表现为促进峰值骨量的增加,对成年骨骼的影响表现为一定程度的骨量增加或保持骨量,对绝经后妇女或老年人骨骼的影响在于尽量减少骨量的丢失速度［7-9］，力学信号是通过作用于细胞骨架来实现对骨骼生长、塑型的调控的，力的变化可以改变或破坏细胞骨架的构象，影响了细胞表面各种受体和酶的位置或结构，造成了细胞功能的失代偿. Sarkar等［10］利用回转加速器研究了成骨细胞ROS的变化，研究发现微重力环境中24 h，35％的ROS细胞不再贴壁，通过DNA片段及TUNEL染色证实这些细胞已经凋亡，伴随着细胞表面的整合素β分布到了核周，肌动蛋白的组成混乱等. 这些结果提示微重力造成的细胞骨架的改变导致了成骨细胞的凋亡. Friedlander等［11］也发现经过2 a训练, 其所测量仅运动员的桡骨、腰椎及股骨BMD指标表现出显著增长. 当然适当的运动负荷及强度会诱导骨量增加和骨的结构改善; 强度过大则造成骨组织微损伤和出现疲劳性骨折,过小或出现废用则导致骨质流失过快. 本实验采用腿尾固定法制造了大鼠左后肢的制动模型，不仅消除了左后肢的承重运动，也避免了自身肌肉的牵拉运动，是理想的限制运动模型. 经过4 wk的制动，从大鼠下肢骨的物理性状和生物力学指标方面观测了限制运动对大鼠下肢骨的影响，发现股骨、胫骨在重量、BMC、BMD、以及生物力学指标等方面与对照组比较明显下降，说明运动对成年动物骨骼系统的影响是全方位的，也反映了运动对成年动物骨骼性状及生物力学特性的保持是非常重要的.

    在限制运动中发生的骨性状和生物力学的变化是否与BMP2表达减少有关，现在还尚无定论，但是有学者认为BMP2通过调控间质细胞向成骨细胞的分化，从而对限制运动时局部骨的变化发挥着重要的调节作用. 本实验通过对限制运动大鼠下肢承重骨BMP2的免疫组化染色发现，限制运动组大鼠股骨、胫骨BMP2的染色显著低于对照组大鼠，提示限制运动降低了BMP2的表达，从而抑制了骨形成. 这说明了制动这一因素可导致BMP2表达降低，这可能是造成限制运动骨骼变化因素之一，而BMP2这一细胞因子是力学信号调控骨骼生长的信号通路中一个重要的因子.

【】
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