小剂量环孢素A治疗溃疡性结肠炎对肠黏膜中NFAT活性及GM?CSF表达的影响

                                              作者：杨玉捷 惠玲 郭艳芳 张红霞 杨伟捷 葛勤利 张方信

【摘要】  　　目的：研究小剂量环孢素A(CsA)的溃疡性结肠炎(UC)患者肠黏膜中核转录因子(NFAT)和粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子(GM?CSF)的变化，及其对黏膜炎症的影响. 方法: UC患者14例经CsA治疗，采用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测肠黏膜NFAT治疗前后活性的变化，半定量RT?PCR法检测肠黏膜中GM?CSF mRNA的改变，治疗前后对肠黏膜炎症程度进行评估. 结果: UC患者治疗后肠黏膜NFAT活性下降(0.80±0.31 vs 0.50±0.20, P<0.05), GM?CSF mRNA表达也有降低（1.09±0.07 vs 0.49±0.03, P<0.01）, 肠黏膜炎症程度也下降（P<0.05）. 结论: 小剂量CsA治疗UC有效,其机制与调控NFAT的转录活性有关，并进一步降低激活因子GM?CSF的表达.

【关键词】  结肠炎 溃疡性 环孢素A 核转录因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

      0引言

    溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）为一种肠道非特异性炎症，它的传统治疗包括激素、5?氨基柳酸、硫唑嘌呤(AZA)或6巯嘌呤(6MP)等，超过60%的重度UC患者活动期需糖皮质激素治疗，但其中仍有15%～25%者激素治疗无效，属于激素抵抗或难治类型. 环孢素A（cyclosporine A, CsA）作为一种有效的免疫抑制药物治疗UC的临床研究显示，小剂量CsA的疗效与大剂量相似［1-3］，CsA主要是通过造成NFAT的激活和转移失败,影响IL?2, IL?3, GM?CSF, TGF?α等多种基因的转录,妨碍Ｔ细胞活化扩增及其免疫应答的产生,从而发挥免疫抑制作用［4］.  我们检测了使用小剂量CsA治疗UC后NFAT转录活性改变和对GM?CSF表达的影响，并观察了肠黏膜炎症程度的改变.

    1对象和方法

    1．1对象住院UC患者14(男12，女2)例，均经纤维结肠镜和病检查确诊. 年龄18～67（43±11.5）岁. 全结肠型8例，左半结肠型4例，直肠炎型2例. 诊断符合现行标准（1993年太原全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会制定），均急性期. UC患者由同一位有经验的病理科医师阅读病理切片，评价其病理表现. 病理组织学分级标准参照［5］. 所有患者接受过0.5～1 a的柳氮磺胺吡啶（SASP）治疗及1～2 wk的糖皮质激素联合治疗，效果均不佳. 随后开始每日静脉滴注CsA 2～4 mg/kg,用药7 d，病情缓解者改每日口服CsA 5 mg/kg，分2次口服. 每位患者CsA治疗前后各取50 mg活检组织，并立即贮存在液氮中备用.

    1.2方法

    1.2.1NFAT测定肠黏膜核蛋白提取参照Cui等［6］方法. 溶液A (mmol/L): HEPES 10 （pH 7.9），  KCl 10， DTT 1.0，  EDTA 0.1， EGTA 0.1; 溶液B (mmol/L): HEPES 20 （pH 7.9）， KCl 0.4，  DTT 1.0， EDTA 0.1， EGTA 0.1; 溶液C： PMSF 10 μmol/L， 肽胺5 mg/L， 抑酶醛肽5 mg/L， 抑肽酶5 mg/L. 冷冻组织50 mg放入匀浆器中研磨后，加入溶液Ａ 400  μL置冰上15 min，加入100 g/L NP?40 25 μL，置震荡器上强烈震荡30 s，1200 r/min低温离心20 min，弃上清，用溶液B 100 μL重悬沉淀，4℃震荡45 min，1200 r/min低温离心5 min，收集上清即为核蛋白提取物，-70℃保存. G?250法测定蛋白质含量，波长595 nm.寡核苷酸探针（序列为5′?AGCTGAAAGGAGGAAAGCAAGAGTCATA?3′，其中含有人类GM?CSF启动子序列［7］，北京亚辉生物医学工程公司），标记［γ?32P］ dATP（北京亚辉生物医学工程公司）， 按试剂盒说明方法进行. 置-20℃保存. 所有样本核蛋白定量为5 μg，在总反应体系20 μL中根据蛋白浓度调整蛋白体积，使蛋白与三蒸水的总体积为10 μL ，再加入Tris.Cl 0.2 mol/L,  NaCl 1 mol/L,  EDTA 10 mmol/L,  MgCl 20 mmol/L,  DTT 10 mmol/L,  poly dI/dC 2 g/L（Sigma公司）各1 μL，250 mL/L甘油3 μL ，置冰上20 min后，加入标记探针1 μL. 电泳对照组蛋白与三蒸水的总体积为9 μL，需加10 pmol/L的未标记探针1 μL. 10×TBE缓冲液5 mL，300 g/L丙烯酰胺10 mL，100 g/L过硫酸胺0.3 mL，TEMED 30 μL，双蒸水35 mL，混匀，灌胶，待胶凝固后，上样，用Bio?Rad 垂直电泳仪，电压30 V电泳2 h. 在干胶仪上干胶40 min，置入暗盒中，覆盖2张胶片，-70℃低温冰箱过夜，冲洗胶片. Bio?Rad Model 583 Gel Dryer干胶仪，Curix HT?330U（AGFA产品）胶片自动冲洗仪. 每条带的放射信号强度采用BAS2000 phosphorimage analyzer (Fuji Film, Minamiashigara, Japan)分析仪计数. 各实验组均作3次重复实验.

    1.2.2GM?CSF测定GAPDH上游引物：5′?CTGGCGCTGAGTACGTCGTG?3′,下游引物：5′?CAGTCTTCTGGGTGGCAGTG?3′, 294 bp, 29个循环；GM?CSF上游引物：5′?TGCAGAGCCTGCTGCTCTTG?3′, 下游引物：5′?CAAGCAGAAAGTCCTTCAGG?3′，400 bp, 30个循环［8］. RT?PCR方法：细胞总RNA的提取按RNA提取试剂盒Trizol (Gibco公司)说明书进行，RNA沉淀溶1 g/L DEPC水中，采用紫外分光光度计测RNA浓度. A260 nm/A280 nm比值需在1.8～2.0，并稀释至1 g/L. 在逆转录体系20 μL中加入模板RNA 1 μL，总RNA达0.1～1.0 μg，Oligo(dT)18 (0.2 g/L) 4 μL，用DEPC处理的双蒸水补足体积至15.5 μL. 于70℃加热5 min. 迅速置冰上，短暂离心. 上述微量离心管内加入：10×反应缓冲液2 μL，4×dNTP mix (10 mmol/L) 1 μL，RNA酶抑制剂(40 mU/L) 0.5 μL, M?MuLV逆转录酶(200 mU/L) 1 μL，38℃恒温60 min，进行逆转录反应. 70℃加热10 min，灭活逆转录酶活性. 取逆转录产物10 μL作PCR扩增. GM?CSF的 PCR参数为94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 60 s, 共30次循环，PCR产物5 μL作20 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙淀染色，用图像分析仪进行分析，以GAPDH作内参照，与目的产物进行比较，对PCR产物相对定量. Gel ?Pro Analyzer 4.0软件(美国Media Cybernetics公司)根据电泳条带的面积和亮度出每个条带的积分吸光度.

    统计学处理:各指标均用SPSS 8.0软件包处理，所得数据用x±s表示，治疗前后比较用Wilcoxon符号秩和检验， P<0.05为有统计学意义.

    2结果

    前NFAT为0.80±0.31(图1A),治疗后NFAT为0.50±0.20(图1B),治疗后表达显著下降(P<0.05). 治疗前GM?CSF/GAPDH的比率为1.09±0.07（图2A）,治疗后为0.49±0.03（图2B），两者比较有统计学意义（P<0.01）. 治疗前病理组织学分级Ⅰ，Ⅱ级的患者有3例，分级Ⅲ，Ⅳ级11例；治疗后Ⅰ,Ⅱ级的患者有10例，分级Ⅲ,Ⅳ级4例，治疗前后比较有显著性差异（P<0.05）.

    3讨论

    静脉使用CsA与糖皮质激素一样对重度UC有效. 尽管菊粉廓清试验示CsA治疗时肾功能有一定程度减退，但临床上血肌酐并未明显持续升高. 有研究显示，小剂量CsA的作用与大剂量相似，低剂量有同样即刻疗效，增大剂量伴发不良反应的风险加大，故我们使用小剂量CsA治疗，也取得较好疗效，病理组织学Ⅲ, Ⅳ级炎症病例明显减少.

    有研究表明，CsA主要是通过造成NFAT的激活和转移失败,调控GM?CSF基因的转录, GM?CSF是一种前炎症因子,可由多种细胞产生,包括T细胞、单核细胞、B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、活化的嗜酸细胞和体外培养的细胞因子活化的内皮细胞等. GM?CSF的作用除了刺激中性粒细胞的增殖外,还能增加TNF,  IL?1, IL?6的基因表达,对炎症起促进作用［9］. Carlson 等［10］研究提示，GM?CSF的浓度在溃疡性结肠炎的直肠段和结肠段均有升高，且中性粒细胞在局部黏膜固有层聚积和激活与这些中性粒细胞激活因子（如：GM?CSF，IL?8）有关，其可能的机制是这些可溶性介质（GM?CSF， G?CSF）导致中性粒细胞凋亡的延迟. 本研究显示，采用小剂量的CsA也能使转录因子NFAT的转录活性降低，从而使GM?CSF基因表达下降，同时黏膜固有层中性粒细胞计数较治疗前也有显著降低. 此研究进一步证实了CsA治疗UC的分子机制，也为探讨理想CsA剂量治疗UC提供分子生物学基础.

　　CsA在临床应用中确有明显不良反应，但本组研究大致观察不良反应不显著，可能与药物剂量小有关. 应用CsA的主要问题还包括药物应用后病情的长期缓解性、与其他药物的合用和预测CsA对不同患者的有效性等，值得我们进行深入研究.

【】
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