U50，488H对大鼠离体心脏的抗心律失常作用
作者：漆伟，魏宝珍，王跃民，裴建明
【关键词】 去甲肾上腺素
Antiarrhythmic effect of U50,488H on isolated rat heart in vitro
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of U50, 488H (a selective кopioid receptor agonist) and noradrenalin (NE, an adrenergic receptor agonist) on ventricular arrhythmias induced by myocardial ischemia and reperfusion in rats in vitro. METHODS: Rats were randomly divided into 5 groups (7 rats in each group), i.e., normal control group, ischemia/reperfusion group (I/R), U50,488H+I/R group, NE+I/R group, U50,488H+NE+I/R group. The isolated heart was perfused by using Langendorff equipment and the front branch of coronary artery was ligated for 20 min, and then the perfusion was resumed for 20 min to engender the I/R condition. U50,488H（5×10-6 mol/L） and NE（1×10-7 mol/L） were used to interfere the effects during myocardial ischemia and reperfusion. Heart rate (HR), arterial blood pressure (ABP), left ventricular pressure (LVP), cardiac function (±dp/dtmax), rate of ventricular tachycardia (VT) and ventricular fibrillation (VF) were determined in rats. RESULTS: ① Every index of the heart functions decreased significantly, and HR increased after myocardial ischemia. With myocardial reperfusion, the condition was improved a little. Compared with I/R group, HR decreased significantly with U50, 488H administration (P<0.05). ② Compared with normal control group and I/R group, the incidence of ventricular arrhythmias and arrhythmia score were enhanced in I/R+NE group (P<0.01). However, it showed that not only the incidence of VT and VF score during myocardial ischemia and reperfusion and ventricular arrhythmias and arrhythmia score of I/R group, but also ventricular arrhythmias and arrhythmia score of I/R+NE group decreased significantly with administration of U50,488H (P<0.01). CONCLUSION: кopioid receptor agonist U50,488H antagonizes the arrhythmias induced by NE during myocardial ischemia and reperfusion.
【Keywords】 U50,488H; NE; ischemia and reperfusion; arrhythmia
【摘要】 目的: 研究к阿片受体选择性激动剂（U50,488H）和肾上腺素受体激动剂（去甲肾上腺素 NE）对大鼠离体心脏缺血再灌注（ischemia and reperfusion, IR）室性心律失常的影响．方法：将35只SD大鼠完全随机设计分为五组（每组7只）：假手术组；单纯缺血再灌注（I/R）组；I/R+NE组；I/R+U50组；I/R+U50+NE组. 分离正常大鼠心脏，采用Langendorff离体心脏灌流方法，结扎冠脉前降支20 min，再灌20 min造成IR. 在此期间分别应用U50,488H（5×10-6 mol/L）和NE（1×10-7 mol/L）进行干预. 并测定心脏功能的相关指标. 结果：①心脏缺血后，心脏各项生理功能指标明显下降，心率上升，再灌注后情况有所恢复. 与IR组相比较，给予U50,488H后，心脏各项生理功能指标变化不明显，心率明显下降(P<0.05). ②假手术对照组偶发早搏，IR组心律失常发生频率明显增加，与IR组相比较，IR+NE组心律失常评分明显增高(P<0.01)；如果提前给予U50,488H，发现不仅可以明显降低IR组缺血和再灌注期间室速和室颤的发生率(P<0.01)，和降低IR组心律失常的评分，而且明显降低IR+NE组心律失常的评分(P<0.01). 结论：κ阿片受体激动剂U50,488H对于NE诱导的缺血再灌注时心律失常有拮抗作用.
【关键词】 选择性к阿片受体激动剂；去甲肾上腺素；缺血再灌注；心律失常
0引言
常见的与心血管功能调节有关的阿片受体为μ，δ和κ等3种亚型. 放射免疫受体分析法及生实验证明，心脏及外周血管的阿片受体主要为κ亚型［1］. 在心肌缺血前预先给予μ，δ阿片受体激动剂可以减少缺血/再灌注心肌梗死面积，或可以减少缺血性室性心律失常的发生，这可能是阿片受体介导的保护作用［2］，但对于κ阿片受体在离体大鼠心脏是否存在上述作用报道较少且结论不一致. 既然κ阿片受体对心血管具有调节作用，在心肌缺血时的直接作用及有关机制有待明确. 我们以往的研究表明，激动κ阿片受体对缺血再灌注性心律失常有重要的拮抗作用［3］，但作用机制尚不清楚. 心肌缺血时，儿茶酚胺活性增高可加重心律失常的发生，由于κ阿片受体具有抑制交感神经递质的合成和释放的作用，而且在实验中激动心脏κ阿片受体可产生负性变力和变时作用，其对去甲肾上腺素所引起的心脏活动加强也具有明显的抑制作用［4-5］. 我们推测在缺血再灌注状态下，激动κ阿片受体对去甲肾上腺素诱发的心律失常可能也有拮抗作用. 我们研究在结扎离体大鼠心脏冠状动脉的同时，给予κ阿片受体选择性激动剂U50,488H，观察其对去甲肾上腺素（NE）诱发大鼠室性心律失常的直接影响.
1材料和方法
1.1材料清洁级SD雌性大鼠，体质量(250±20) g(第四军医大学实验动物中心提供). 离体心脏实验在Langendorff装置上进行(第四军医大学生理学教研室自己设计制作). 使用RM6280智能多道生物记录分析处理软件（第四军医大学，成都仪器厂）和U50，488H（trans3,4dichloroNmethyl［2(1pyrrolidinyl) cyclohexyl］ benzeacetamidel）购自Sigma公司. KerbsHenseleit Buffer(KH液)灌流，KH液（mmol/L）的成分：NaCl 118.5，KCl 4.8，NaHCO3 25.0，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，CaCl2 1.7,葡萄糖12.0，以HCl调整至pH 7.4.
1.2方法
1.2.1大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型的建立大鼠颈椎脱臼后，迅速分离出心脏置于0℃的KH液中，迅速清除心脏中淤血和心脏周围结缔组织，并悬挂于离体心脏灌流仪上，用(37±5)℃充有950 mL/L O2+50 L/L CO2混合气体饱和的KH液灌流. 将带有水囊的导管经左房插入左心室并固定，连接压力换能器，同步记录心电图、心室压力及心室压力微分.
1.2.2离体实验SD大鼠35只，采用完全随机设计分为五组：①假手术组（n=7），仅在冠脉下穿线，观察50 min内有无心律失常发生和心率的变化. ②单纯缺血再灌注组（对照组）（n=7），KH液灌流稳定10 min，保持灌流，结扎冠状动脉前降支20 min，松开结扎继续灌流20 min. ③缺血再灌注+U50,488H组（n=7）KH液灌流稳定10 min后改用含有U50，488H （5×10-6 mol/L）的KH液灌注，并结扎冠状动脉前降支，20 min后松开结扎并保持继续灌注20 min. ④缺血再灌注+NE组(n=7)，KH液灌流稳定10 min后改用含有NE（1×10-7 mol/L）的KH液灌注，并结扎冠状动脉前降支，20 min后松开结扎并保持继续灌注20 min. ⑤缺血再灌注+U50,488H+NE组（n=7），KH液灌流稳定10 min后改用含有NE（1×10-7 mol/L），U50，488H （5×10-6 mol/L）的KH液灌注，并结扎冠状动脉前降支，20 min后松开结扎并保持继续灌注20 min.
1.2.3心律失常评分标准心律失常的判断按照Lambeth会议标准，评分则Cuertis和Walker等人的评分规则. 具体如下：①0分，无心律失常；②1分，偶发性室性早搏（指1 min内发生3次以下的室性早搏）；③2分，频发性室性早搏（指1 min内发生3次或3次以上的室性早搏）；④3分，偶发性室性心动过速（指1 min内发生3次以下的室性心动过速）；⑤4分，频发性室性心动过速（指1 min内发生3次或3次以上的室性心动过速）或偶发性室颤（指1 min内发生3次以下的室颤）；⑥5分，频发性室颤（指1 min内发生3次或3次以上的室颤）或死亡.
1.2.4观察指标①心率（HR）. ②动脉压（ABP）. ③左心室内压（LVP）. ④室速发生率（VT%）. ⑤室颤发生率（VF%）.
统计学处理：实验得到的计量数据以x±s表示，组间均数比较采用方差分析以及LSDt检验，率的比较采用χ2检验，P0.05表示统计学上显著性差异.
2结果
2.1U50,488H对大鼠血流动力学指标的影响对不同组别大鼠血流动力学指标进行观察，结果发现与对照组相比：I/R组大鼠在心肌缺血时心率无明显变化，动脉压、左心室内压及收缩、舒张功能明显下降(P<0.01)；在再灌注期间，上述指标可逐渐恢复，但仍未能达到心脏缺血前水平. I/R组大鼠在给予U50,488H后，出现心率进一步减慢(P<0.01)，动脉压、左心室内压及收缩和舒张功能虽有进一步下降趋势，但与I/R组比较无显著差异，与I/R组所不同的是，在再灌注时大鼠动脉压、左心室内压以及心脏收缩和舒张功能无明显回升. 表1所示的是对照组、缺血再灌注组和缺血再灌注组给予U50,488H后缺血20 min末再灌注即刻时间点的资料.
表1三组大鼠血流动力学指标的变化（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs假手术组；cP<0.05 vs缺血再灌注组.
2.2U50,488H，NE对IR过程中心律失常的影响假手术对照组大鼠在观察期间内仅偶尔出现室性早搏，未发生室性心动过速和室颤. IR组大鼠在心肌缺血时，心电图ST段明显抬高，可出现室性早搏、室性心动过速和室颤等心律失常(图1)；在再灌注即刻，又出现较为严重的室性心动过速和室颤. 与对照组比较，IR组心律失常的评分明显增加，在缺血期间和再灌注期间的心律失常评分分别是3.2±0.41和3.5±0.22. I/R+U50,488H组大鼠在心肌缺血再灌注期间，也可出现室性早搏、室性心动过速（但无室颤）等心律失常，与I/R组相比，其持续时间明显缩短，发生率及心律失常评分亦明显降低(P<0.01).
A：正常窦性心律；B：室性早搏；C：偶发性室性心动过速；D：频发性室性心动过速；E：心室纤颤；F：心室纤颤致死.
图1正常期及缺血期各种情况下大鼠心电图（略）
与IR组相比较，IR+NE组心律失常评分明显增高(P<0.01)，特别是再灌注期间室速VT%和室颤VF%的发生率明显增加(P<0.01)，如果提前给予U50,488H，发现可以明显降低IR+NE组心律失常的评分(P<0.01)，可降低到I/R+U50,488H组的评分水平（表2，图2）.
3讨论
本研究的主要发现是，选择性к阿片受体激动剂U50,488H不仅具有抗缺血再灌注性心律失常的作用，而且能够显著抑制去甲肾上腺素加重的缺血再灌注性心律失常发生的作用，研究还进一步证实了它能显著降低大鼠心率、动脉压、左心室内压及收缩、舒张功能，因而具有明显的改变心脏节律和负性肌力作用.
表2U50,448H对离体大鼠缺血再灌注性心律失常的影响（略）
bP<0.01 vs缺血再灌注组；dP<0.01 vs缺血再灌注+NE组. VT: 室性心动过速；VF: 心室纤颤；U50: U50,488H；NE:去甲肾上腺素.
A：假手术组；B：缺血再灌注组；C：缺血再灌注+NE组；D：缺血再灌注+U50组；E： 缺血再灌注+U50+NE组.
图2缺血10min内不同组别典型大鼠心律失常心电图（略）
U50,488H作用的具体机制尚不清楚，目前存在很大争议. 有学者认为U50,488H的抗心律失常作用是通过阻滞β受体激活通路和延长动作电位时程来实现的［6］. 也有人认为U50,488H可激活PTX敏感性G蛋白通路，从而使胞内IP3，PKC活性增加，后者通过预处理的机制对心脏产生保护作用. 比较广泛的观点是κ阿片受体的激活通过预处理机制可能既产生了一个急性，也产生了一个慢性的心脏保护作用，其中涉及的信号途径包括: Gi/o蛋白、PKC，TK，MAPK和KATP等［7］. к阿片受体的激活与细胞内相关机制还有待进一步研究.
由于氧自由基生成增多、酸中毒以及钙超载等因素导致心肌细胞超微结构明显破坏、心功能受损，严重时还可造成心肌梗死并伴有严重的心律失常. 若提前给予缺血心肌预处理，则可以对心脏起保护作用，能够降低心律失常的发生率，并可减少心肌梗死面积［8］. 有人发现μ，δ阿片受体在心肌缺血再灌注过程中发挥着十分重要的作用，在心肌缺血前预先给予μ，δ和к阿片受体激动剂都可以减少缺血再灌注引起的心肌梗死的面积，或可以减少缺血再灌注性室性心律失常的发生［2，9］. 但需十分注意的是他们所得结果都是在缺血前给药，造成预处理，而未观察这些受体激动剂对缺血性心律失常的直接作用. к阿片受体激动后具有明显降低心率、改变心脏节律和负性肌力作用，所以推测应该具有像β受体阻滞剂类似的抗心律失常的作用. 我们的进一步研究也发现к阿片受体在心肌缺血再灌注过程中亦起着直接的作用，在缺血再灌注的同时给予U50,488H来激活к阿片受体，也发现具有同样明显的心脏保护作用，还能够减少心律失常的发生，后者主要表现为缺血再灌注室性心动过速和室颤的持续时间缩短和发生率降低，这些作用可被选择性к阿片受体阻断剂norBNI所抑制［10］. 我们以往的这些实验表明，选择性к阿片受体激动剂U50,488H具有良好的直接抗心律失常作用，本实验则进一步观察到U50,488H不仅可以降低大鼠缺血性心律失常的严重程度和发生率，而且还能够显著拮抗在IR过程中NE所诱导的心律失常的作用，并降低其严重程度. 实验结果一方面验证了我们的推测，另一方面，也显示了к阿片受体激动剂U50,488H所具有的潜在的临床使用价值.
总之，本研究表明激活к阿片受体具有直接改变心脏节律的作用；同时给予U50,488H，对缺血再灌注性心律失常和去甲肾上腺素诱发的心律失常可产生明显的拮抗作用，其作用机制尚有待于进一步研究.
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