p38 MAPK在嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放MCP
【关键词】 上皮细胞
Regulatory role of p38 MAPK for MCP1 release from activated bronchial epithelial cells by eosinophils
【Abstract】 AIM: To investigate the release of monocyte chemoattractant protein （MCP）1 from the coculture of human bronchial epithelial cells and eosinophils and the related mechanisms. METHODS: MCP1 in culture supernatant was determined by Cytometric Bead Array (CBA) Kit in flow cytometry to compare MCP1 release in bronchial epithelial cells and eosinophils cultured alone or together, and investigate the inhibitive effect of SB 203580, a selective inhibitor of p38 MAPK, on MCP1 release. The reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to analyze the gene expression of MCP1 in bronchial epithelial cells during coculture with eosinophils and the effect of SB 203580. RESULTS: The interaction of eosinophils and bronchial epithelial cells was found to upregulate the gene expression of MCP1 in epithelial cells. MCP1 in coculture supernatant of bronchial epithelial cells and eosinophils was elevated significantly ［(1266±127) ng/L vs (134±25) ng/L,P<0.001］. Fixed eosinophils, which lost the ability to release MCP1, could also elevate epithelial cells to release MCP1 ［(773±48) ng/L vs (107±15) ng/L, P<0.001］ in coculture. SB 203580 could effectively inhibit MCP1 gene expression of bronchial epithelial cells during coculture with eosinophils, and decreased the release of MCP1 in the coculture of epithelial cells and eosinophils or fixed eosinophils ［(1335±115) ng/L vs (481±42) ng/L, (868±89) ng/L vs (239±26) ng/L, P<0.001］. CONCLUSION: Eosinophils can activate bronchial epithelial cells to express MCP1 in coculture by p38 MAPK pathway so as to regulate the airway inflammatory reaction.
【Keywords】 bronchi; epithelial cells; eosinophils; monocyte chemoattractant protein1; p38 MAPK
【摘要】 目的： 探讨支气管上皮细胞与嗜酸性粒细胞联合培养过程中炎性介质的释放及其机制. 方法：应用流式细胞微珠实验（CBA）方法定量比较嗜酸性粒细胞、支气管上皮细胞及其联合培养上清液中单核细胞趋化蛋白（MCP）1的释放以及p38 MAPK抑制剂SB 203580干预的影响；用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）分析联合培养过程中嗜酸性粒细胞对支气管上皮细胞MCP1基因表达的活化及SB 203580对MCP1表达的抑制作用. 结果： 经嗜酸性粒细胞活化后，支气管上皮细胞中MCP1基因表达明显上调；嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞联合培养上清液中MCP1蛋白质释放显著增加［(1266±127) ng/L vs (134±25) ng/L, P<0.001］；多聚甲醛固定后的嗜酸性粒细胞不能释放MCP1，但其在与支气管上皮细胞联合培养过程中仍可增加支气管上皮细胞释放MCP1 ［(773±48) ng/L vs (107±15) ng/L, P<0.001］；p38 MAPK抑制剂SB 203580可有效抑制嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞表达MCP1基因，显著降低正常嗜酸性粒细胞和多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞联合培养过程中MCP1的释放［(1335±115) ng/L vs (481±42) ng/L和(868±89) ng/L vs (239±26) ng/L, P<0.001］. 结论： 嗜酸性粒细胞可通过p38 MAPK信号传导通路活化支气管上皮细胞表达MCP1，调控过敏性气道炎症反应.
【关键词】支气管；上皮细胞；嗜酸细胞；单核细胞化学吸引蛋白质1；p38 MAPK
0引言
过敏性哮喘的显著特点就是大量炎性细胞，特别是嗜酸性粒细胞在支气管炎症部位聚积，活化后的嗜酸性粒细胞可通过脱颗粒释放嗜酸性粒细胞阳性蛋白（ECP）、主要碱性蛋白(MBP)等毒性蛋白，而这些毒性蛋白可造成支气管上皮损伤［1］. 损伤的支气管上皮修复和气道重建可导致气道水肿、增厚、狭窄和对不同刺激的反应性增高，从而引发常见的咳嗽、呼吸困难等一系列临床症状. 支管上皮对外环境的屏障功能已被广泛认识，但作为哮喘炎症反应的发生部位，其在过敏性哮喘发生、中的免疫调控作用未能引起广泛重视. 我们通过嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞接触培养为实验模型，探讨哮喘过程中嗜酸粒细胞从外周血移行至支气管上皮后，通过活化支气管上皮释放炎性介质细胞趋化因子MCP1，调控过敏性哮喘炎性反应的过程.
1材料和方法
1.1材料密度1.082 kg/L Percoll溶液: 混合87.92 mL Percoll原液(密度1.130, 瑞典Amersham公司产品)，15 mL 1.5 mol/L NaCl和47.1 mL去离子水；抗CD16抗体磁珠和细胞磁性分离系统（MACS）购自德国Miltenyi Biotec公司；p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制剂SB 203580购自美国Calbiochem 公司；DMEM/F12，RPMI 1640细胞培养液购自美国Gibco Invitrogen公司；RNA抽提试剂TRIReagent购自美国Molecular Research Center公司；人细胞趋化因子CBA测定试剂盒购自美国BD公司；第一条链cDNA合成试剂盒购自瑞典Amersham 公司；MCP1和βactin PCR扩增引物为美国Invitrogen公司产品；流式细胞仪（FACSCalibur）为美国BD 公司产品；DNA热循环仪（PTC200）为美国MJ公司；新鲜人全血由香港红十字会输血服务中心提供.
1.2方法
1.2.1嗜酸性粒细胞分离新鲜人全血中血细胞通过密度为1.082 kg/L Percoll溶液离心分层，去除淋巴细胞层后用冰浴去离子水裂解红细胞，所剩嗜中性、酸性粒细胞与抗CD16抗体磁珠反应使细胞表面带有CD16蛋白质的嗜中性粒细胞与磁珠结合. 当嗜中性、酸性粒细胞混悬液通过磁性分离柱时，由于磁性作用使结合在磁珠上的嗜中性粒细胞吸附于分离柱上，而表面不表达CD16的嗜酸性粒细胞则可以顺利通过分离柱. 分离后的嗜酸性粒细胞用伊红染色鉴定其纯度，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中待用.
1.2.2嗜酸性粒细胞固定分离后的嗜酸性粒细胞用10 g/L多聚甲醛在室温中固定3 h，再用含20 mL/L小牛血清的PBS清洗3遍，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中待用.
1.2.3细胞培养人支气管上皮细胞系（BEAS2B，美国ATCC公司购买）置含100 mL/L小牛血清的DMEM/F12细胞培养液中，37℃, 50 mL/L CO2孵育.
1.2.4MCP1释放试验BEAS2B细胞被培养在24孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，移净原培养液并立即加入1 mL含1×109/L正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入100 mL/L小牛血清）RPMI 1640细胞培养液，嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养12 h.
1.2.5p38 MAPK抑制剂干预实验BEAS2B细胞被培养在24孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，弃原培养液并立即加入含100 mL/L 小牛血清的RPMI 1640细胞培养液0.5 mL，然后加入20 μmol/L SB 203580培养1 h，再加入含2×109/L正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入100 mL/L 小牛血清）RPMI 1640细胞培养液0.5 mL. 1×106正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞在10 μmol/L SB203580存在情况下联合培养12 h.
1.2.6细胞培养上清液收集正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养到实验设计时间后，收集培养上清液，510 g, 4℃离心10 min，分离无细胞上清液并立即置于-80℃保存.
1.2.7细胞趋化因子测定细胞培养上清液中的细胞趋化因子MCP1应用流式细胞微珠实验（CBA）试剂盒定量（美国BD公司产品）［2］.
1.2.8BEAS2B细胞总RNA抽提融合的BEAS2B细胞与4×106嗜酸性粒细胞在4 mL含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中联合培养12 h（p38 MAPK抑制剂实验，先加入20 μmol/L SB 203580与BEAS2B细胞培养1 h）. 移去细胞培养液后，BEAS2B细胞用冰育PBS冲洗三次，BEAS2B细胞总RNA用TRIReagent RNA提取试剂盒根据操作说明进行提取. 所提RNA质量通过电泳方法鉴定，分光光度法定量其浓度，于-80℃冰冻保存待用.
1.2.9RTPCR分析BEAS2B细胞MCP1基因表达细胞总RNA用第一条链cDNA合成试剂反转录到cDNA再行PCR反应. PCR反应混合物为3 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTPs, 1 单位DNA聚合酶, 50 pmol 5′和3′引物. PCR扩增引物: MCP1 上游5′AATGCCCCAGTCACCTGCTGTTAT3′，下游 5′GCAATTTCCCCAAGTCTCTGTATC3′, 最后的扩增产物为427 bp［3］. βactin 上游5′AGCGGGAAATCGTGCGTG3′，下游 5′CAGGGTACATGGTGGTGCC3′, 最后的扩增产物为300 bp［4］. PCR扩增条件： 94℃预变性后，94℃ 1 min, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min，共30个循环，最后一个循环后72 ℃延伸10 min. PCR反应在DNA热循环仪中进行.
统计学处理： 所有实验均重复三次（n=3），嗜酸性粒细胞和BEAS2B细胞联合培养及两种细胞各自培养的上清液中生成MCP1的比较用方差分析，两种细胞在有SB 203580体系中联合培养与不含SB 203580体系中联合培养所释放MCP1的比较用t检验.
2结果
2.1与嗜酸性粒细胞联合培养对BEAS2B细胞中MCP1基因表达的影响BEAS2B细胞单独培养仅有很少量细胞趋化因子MCP1基因表达, 与嗜酸性粒细胞联合培养12 h后，BEAS2B 细胞中MCP1基因表达显著上调（图1）.
BE: BEAS2B 细胞; BE+EOS: BEAS2B细胞和嗜酸性粒细胞联合培养.
图1与嗜酸性粒细胞联合培养对BEAS2B 细胞MCP1基因表达的诱导作用（略）
2.2嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养对MCP1释放的影响 嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养12 h，与两种细胞单独培养比较，培养上清液中MCP1释放显著增加［（1266±127) ng/L vs (134±25) ng/L, P<0.001，图2A］. 经多聚甲醛固定后，死亡的嗜酸性粒细胞保持完整的细胞形态和结构，在与BEAS2B细胞联后培养过程中，仍然能够活化BEAS2B细胞释放MCP1 ［（773±48） ng/L vs （107±15） ng/L, P<0.001，图2B］.
2.3SB 203580对MCP1释放的影响在嗜酸性粒细胞和BEAS2B细胞联合培养体系中加入p38 MAPK抑制剂SB 203580，两种细胞联合培养上清液中MCP1生成显著下降［（1335±115） ng/L vs （481±42） ng/L, P<0.001，图3A］. 从图3B中可以发现，SB 203580可以抑制多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞刺激BEAS2B细胞释放MCP1 ［（868±89） ng/L vs （239±26） ng/L］.
2.4SB 203580对嗜酸性粒细胞诱导BEAS2B细胞MCP1基因表达的影响p38 MAPK抑制剂SB 203580能够有效抑制嗜酸性粒细胞对BEAS2B细胞MCP1基因表达的诱导效应（图4）.
BE: BEAS2B细胞; EOS: 嗜酸性粒细胞; EOS*: 多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞; BE+EOS: BEAS2B细胞和嗜酸性粒细胞接触联合培养; BE+EOS*: BEAS2B细胞和多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞联合培养; bP<0.001 vs BE and EOS(EOS*), n=3.
图2嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养对MCP1释放的影响（略）
BE+EOS(或EOS*): BEAS2B细胞和正常(多聚甲醛固定)嗜酸性粒细胞接触联合培养; BE+EOS(或EOS*)+SB: BEAS2B细胞和正常(多聚甲醛固定)嗜酸性粒细胞在有SB 203580存在体系中联合培养; b1P<0.001 vs BE+EOS; b2P<0.001 vs BE+EOS*; n=3.
图3SB 203580对嗜酸性粒细胞诱导BEAS2B细胞释放MCP1的影响 （略）
BE: BEAS2B 细胞; BE+EOS: BEAS2B细胞和嗜酸性粒细胞联合培养.
图4SB 203580对嗜酸性粒细胞诱导BEAS2B细胞MCP1基因表达的影响（略）
3讨论
众所周知，支气管上皮的黏膜纤毛系统在气道防御中能够发挥机械屏障作用. 近年来的研究结果表明，支气管上皮在支气管炎性疾病中可能具有重要的免疫调控功能［5］，而此种功能的启动除外源性刺激外，可能与炎性细胞接触及炎性细胞分泌的炎性介质对其活化有关［6］. 本研究结果显示，在过敏性炎症反应中扮演重要角色的嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞系BEAS2B细胞接触培养，可有效介导重要炎性介质MCP1的表达和释放. 越来越多的研究结果显示，MCP1在生物体免疫反应中具有多重作用，其异常表达与包括过敏性哮喘在内的多种疾病的发生、有关［7-8］. 作为一种重要的细胞趋化因子，MCP1能够趋化和活化诸如树突状细胞、肥大细胞、杀伤细胞、T淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞等炎性细胞［9］. MCP1能够刺激肥大细胞脱颗粒,释放组织胺等多种炎性介质,诱导气道高反应性（AHR），其结果可进一步趋化嗜酸性粒细胞等炎性细胞向肺部炎性部位聚积［10］. 近年来的研究结果表明，在免疫性炎症反应过程中，p38 MAPK信号传导途径在调控炎性介质的合成和释放中起重要作用［11］. 细胞接受刺激后,胞浆中p38 MAPK蛋白质被磷酸化，具有酶活性的磷酸化p38 MAPK进入胞核并使转录因子ATF2发生磷酸化，磷酸化的ATF2对某些炎性介质相关基因的转录具有调控作用［12］. 作为p38 MAPK 选择性抑制剂，SB 203580可抑制p38 MAPK对某些炎性介质相关基因转录的调控. 本研究发现，在联合培养体系中加入SB 203580可有效抑制嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞表达MCP1基因，显著减少嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞联合培养上清液中MCP1的释放. 上述研究结果意味着嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放MCP1可能通过激活p38 MAPK信号传导途径实现的.
【】
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