骨形成蛋白在胫骨截骨快速延长成骨过程中的表达及意义

                 作者：范国华，林月秋，李主一，周仲英   

【关键词】  骨形态发生蛋白质类

    Expression of bone morphogenetic protein and its significance during distraction  osteogenesis following tibial osteotomy
　　
　　【Abstract】 AIM: To study the expression of bone morphogenetic protein(BMP) and its significance during distraction osteogenesis. METHODS: Rabbits were used to make the models of tibial lengthening by osteotomy and distraction and sacrificed at 5, 10, 15, 20, 30 and 40 d after the interventions. BMP at the margins of bone formation in different time periods of tibial  lengthening was detected immunohistochemically using monoclonal antibody against BMP. RESULTS: There was a persistent expression of BMP in the whole course of bone lengthening, but the position of BMP expression varied in different time periods. The expression of BMP can be found in most of the cells and tissues except inflammatory cells, osteoid and  trabecular bone. There was a high level expression of BMP in mesenchymal cells, chondrocytes, osteoblasts, osteocytes and marrow cells. CONCLUSION: BMP plays an important role in the course of distraction osteogenesis. The deficiency of BMP may be a main reason for bone nonunion in distraction osteogenesis.
 
　　【Keywords】 bone morphogenetic proteins; osteogenesis, distraction; bone regeneration;   bone nonunion

　　【摘要】 目的： 探讨快速延长成骨过程中骨形成蛋白（BMP）的表达及意义. 方法： 制作兔胫骨截骨快速延长动物模型，分别于延长第5, 10, 15, 20, 30和40日在延长区取材，以抗骨形成蛋白单克隆抗体(BMPMcAb)行SP法免疫组化染色光镜观察. 结果： 在骨延长的整个过程中均有BMP的表达，不同时相BMP表达的部位不同. 除炎症细胞、类骨样组织及骨小梁外，几乎所有细胞及组织均有BMP存在. 间充质细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、骨髓细胞BMP呈高表达. 结论： BMP在骨延长成骨过程中发挥着重要作用. BMP表达量不足可能是导致快速骨延长骨不连接的重要因素.
 
　　【关键词】 骨形态发生蛋白质类；骨生成，内脱位；骨再生；骨不连接

　　0引言

　　自1905年Codivilla首次报道应用截骨术后分次牵开的方法施行股骨持续延长术以来，骨延长技术在临床得到了广泛应用. 尤其是苏联学者Ilizarov研究发现了组织牵张再生、提出了骨骼延长技术的生物学和力学原则以后，骨延长已经成为矫形外科各种骨折不连接、骨缺损等的重要手段［1-2］. 然而延长术自身存在的各种并发症严重影响其临床应用及治疗效果［2-3］. 现有研究已经证实［3-6］，骨折愈合过程中有多种骨生长因子参与，其中骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP) 是近年来最为引人注目的一组新型骨生长因子，在骨折愈合过程中发挥着重要作用，且应用外源性BMP可大大缩短骨折愈合所需时间并提高新生骨的质量. 骨延长是一种特殊形式的骨折，BMP在骨延长过程中的表达、作用及潜在应用前景已成为目前研究热点［2-3,10］. 我们应用抗骨形成蛋白单克隆抗体(BMPMcAb)研究了兔胫骨截骨快速延长成骨过程中BMP的表达，并就BMP在骨延长区骨愈合过程中的作用作了初步探讨.

　　1材料和方法

　　1.1材料选用3 mo龄清洁级健康日本大耳白兔18只，均为雌性，体质量2.0～2.3（平均2.1） kg. 每只兔右后肢为手术延长侧，左后肢为自身正常对照. 制作右胫骨干中下1/3处截骨延长模型. 术后第4日开始延长，延长速度2.0 mm/d，分两次完成，共延长10 d. SP免疫组化试剂盒(北京中山生物技术公司). 抗骨形成蛋白单克隆抗体(BMPMcAb 1∶50第四军医大学口腔医学院病教研室).
 
　　1.2方法分别于延长第5, 10, 15, 20, 30和40日随机抽取3只动物，空气栓塞致死后完整切取两截骨端间骨延长区新生骨组织，固定于10 g/L福尔马林溶液、4℃保存24～48 h, 4℃低温下以5 g/L硝酸脱钙，流水冲洗、修块，常规脱水、浸蜡、包埋并切片，以抗骨形成蛋白单克隆抗体(BMPMcAb)为标记物，行SP法免疫组化染色，光镜观察延长区骨愈合过程中BMP的分布及细胞定位情况. BMPMcAb为小鼠IgG2a，工作浓度1∶50.  切片常规脱蜡，3 g/L H2O2孵育5 min，蒸馏水冲洗并PBS浸泡5 min，滴加10 g/L正常山羊血清室温放置10 min，倾去血清后加入BMPMcAb，另设空白对照和阴性对照，4℃湿盒内过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记羊抗鼠IgG 37℃孵育30 min, PBS冲洗3×3 min，辣根酶标记的链霉卵白素37℃孵育30 min，PBS冲洗3×3 min，加0.01 g/L DAB显色3 min，自来水冲洗中止反应，常规苏木素复染，脱水、透明、吹干、封片后光镜下观察. 阳性结果为组织及细胞中出现棕色着色.

　　2结果

　　2.1动物情况全部动物术毕麻醉清醒后均恢复正常生理活动(如饮水、磨牙等)，伤肢即能轻度着地负重，睡眠及休息时采取左侧卧位. 18只动物均存活至预定观察时间，整个实验过程未发生克氏针针道感染迹象. 全部动物均顺利延长，其中15只观察时间满10 d以上并完成了预定延长期. 延长期间，后肢延长侧肢体长度较对侧逐渐增加，延长区皮肤紧张，平均延长长度（20.2±0.8） mm，延长幅度为原胫骨长度的（19.55±0.08）%.
 
　　2.2延长区新骨组织形态学检查

　　2.2.1大体观察延长侧胫骨长度较对侧正常胫骨明显增加，去除骨外固定架后，截骨远端肢体均存在摆动现象. 切开皮肤见延长区周围肌组织变纤细，且与骨膜不易分离. 仔细剔除环周软组织后，见延长区骨膜完整且明显增厚，整个延长观察期内未见明显的骨膜撕裂痕迹. 延长5及10 d时延长区内见红色血肿块. 15 d近截骨端处出现少量软性骨痂，延长区中央软组织丰富. 20 d时软性骨痂数量增多，软组织大量存在. 30 d时截骨两端片状骨痂偏心性存在，质地不均，骨痂周围及延长区中央仍存在数量较多的软组织. 40 d时新生骨痂增粗、质地较硬，但仍呈偏心性存在，且延长区中央为软组织所分隔，形成骨不连，新生骨痂与截骨断端界限清晰.
 
　　2.2.2组织病免疫组化观察延长5 d时出血灶与血肿机化灶交替存在,网状纤维、胶原纤维及其间的无定形基质、红细胞、新生毛细血管的内皮细胞呈BMP阳性表达，数量较多的间充质细胞、脱落的骨碎片、新形成的软骨细胞和软骨基质富含BMP，呈强阳性棕色着色，而炎症细胞及各种细胞的细胞核则无BMP存在. 10 d时BMP表达阳性的纤维组织、间充质细胞和软骨岛数量增多，相邻软骨岛融合成片,纤维组织内外的红细胞和血肿机化灶仍呈阳性染色，脱落的骨碎片大多中央部染色淡、外周部呈BMP强阳性. 15 d出现软骨内化骨与膜内化骨同时存在,变性肥大的软骨细胞胞膜及周围溶解的软骨基质、类骨样组织表面的成骨细胞及移行部组织、延长区两端骨小梁网腔内的疏松纤维组织BMP表达水平高，固缩的软骨细胞胞浆BMP表达下降. 类骨样组织及骨小梁基本无BMP存在. 延长区中央及周围的纤维组织和大量的间充质细胞仍呈BMP阳性(图1A, B).

　　A： 软骨内化骨区；B： 膜内化骨区.

　　图1延长15 d BMP均呈高表达SP ×200（略）

　　20 d延长区两端类骨样组织与软骨性骨痂交互联接成片网状幼稚的骨小梁，顺应力方向纵向排列，中央纤维组织生长带广泛. 除大量的纤维组织及间充质细胞BMP表达阳性外，骨小梁表面的骨细胞、小梁边缘成行排列的成骨细胞及网腔内的疏松纤维组织均呈BMP强阳性. 纤维组织内新出现的类骨样组织有时可见强弱不一的棕色染色. 偶见BMP高表达的软骨内化骨灶附近部分软骨细胞无BMP表达. 延长区中央染色阳性的间充质细胞数量较少. 30 d见小梁骨纤细，其间纤维组织和成骨细胞多，小梁基质内可见钙盐沉积. 为数不多的破骨细胞开始出现，新生骨改建开始. BMP表达阴性的片网状骨小梁偏心性存在于延长区两端，其间BMP阳染的纤维组织、成骨细胞和骨细胞数量多，部分骨小梁网腔内因纤维降解而呈BMP阴性表达. 破骨细胞胞浆也含有少量的BMP. 阳染的纤维组织仍大量存在，而BMP高表达的间充质细胞数量不多. 40 d见偏心性生长的骨小梁内，BMP高表达的成骨细胞和骨细胞仍大量存在. 新形成的骨髓腔内，骨髓细胞和纤维组织 BMP阳性. 延长区内阳染的纤维组织数量仍多，中央部分呈明显的阳性着色区域. 新出现的软骨灶和膜性成骨区BMP表达阳性.

　　3讨论
    
　　骨延长是一个在机械牵张应力刺激下的特殊骨再生技术，其骨再生修复涉及多种骨生长因子、细胞因子和激素的相互作用和调节［2-3,10］. BMP是迄今发现的最重要的骨生长因子之一，能诱导间充质干细胞向成骨细胞分化［1,3,6,10］. 本实验组织学观察显示，在延长期延长区域主要以血肿机化为主，而延长固定初期即出现牵张骨再生修复的特征性成骨模式软骨内化骨与膜内化骨同时存在、成熟骨小梁与新生幼稚骨组织并存、各阶段成骨细胞及成骨前体细胞共存，这与［7-9,11］报道相一致. 免疫组化观察显示在骨延长整个过程中均有BMP的表达. 延长区除炎性细胞以外，几乎所有细胞均有不同程度的BMP表达. 软骨细胞、软骨基质、成纤维样间充质细胞、成骨细胞、骨细胞、骨髓细胞、血管内皮细胞、降解变性之红细胞甚至破骨细胞均有强弱不等的BMP存在. 随着骨化进程，BMP表达亦减少，类骨样组织及成熟骨小梁基本不含BMP，但存在其间的成骨细胞、骨细胞、骨髓细胞及髓腔内纤维组织仍有BMP的表达. 富含BMP的成纤维样间充质细胞在延长各个时相点均存在，只是随着延长骨的逐渐成熟，其细胞数量亦减少. 由截骨断端降解脱落的骨碎片在初期富含BMP，但随骨延长进程其BMP含量迅速下降，说明每天延长造成的骨痂骨折即骨断端骨组织细胞降解释放出的BMP在延长区骨愈合过程中也起着非常关键的作用. 实验观察到，在任一时间点延长区周围的骨膜均保持完整、无撕裂且明显增厚. 这种完整的骨膜形成一个闭合空腔，有利于延长区域局部BMP 浓度的聚集和提高. 实验结果提示BMP在牵张骨延长成骨过程中发挥着重要作用，与Rauch等［9］和Campisi等［10］的报道一致.

　　已有的研究证实［7,9,11］，以兔为实验性胫骨截骨延长动物模型，当每日的延长速度超过2.0 mm时，延长区骨愈合将呈现骨不连接或延迟愈合. 本实验选择了2.0 mm/d的快速胫骨截骨延长动物模型，结果证实延长40 d即固定期30 d时兔胫骨截骨延长区域均呈现了骨不连接. 既然富含BMP的各种成骨细胞及成骨前体细胞在延长区任一时相点均存在，而且在延长成骨的全过程中都有BMP的高水平表达，为什么每日2.0 mm的延长速度会导致延长区域的骨不连接？是否由于快速骨延长过程局部BMP表达量仍不足？可否应用外源性BMP来提高延长区成骨的速度与质量以及何时以何种方式补充BMP等问题仍值得进一步研究探讨.

　　【文献】

　　［1］ Rodeo SA, Hidaka C, Maher SA. Whats new in orthopaedic research ［J］. J Bone Joint Surg Am, 2005,87:2356-2365.

　　［2］ DeCoster TA, Gehlert RJ, Mikola EA, et a1. Management of posttraumatic segmental bone defects ［J］. J Am Acad Ortho Surg, 2004,12:28-38.

　　［3］ Termaat MF, Den Boer FC, Bakker FC, et al. Bone morphogenetic proteins. Development and clinical efficacy in the treatment of fractures and bone defects ［J］. J Bone Joint Surg Am, 2005,87:1367-1378.
　　
　　［4］ Mont MA, Ragland PS, Bridget B, et al. Use of bone morphogenetic proteins for musculoskeletal applications: An overview ［J］. J Bone Joint Surg Am, 2004,86:41-55.
 
　　［5］ 郭继东，孙大铭. BMP基因与骨修复［J］. 矫形外科杂志, 2003,11(21):1497-1498.

　　［6］ 彭吾训，龚跃昆，李世和，等. BMP在骨科领域中的临床应用研究进展［J］. 中华临床医学杂志,2005,3(3):215-218.

　　［7］ Li G, Bouxsein ML, Luppen C, et al. Bone consolidation is enhanced by rhBMP2 in a rabbit model of distraction osteogenesis ［J］. J Orthop Res, 2002,20:779-788.

　　［8］ Edwards RB, Seeherman HJ, Bogdanske JJ, et a1. Percutaneous injection of recombinant human bone morphogenetic protein2 in a calcium phosphate paste accelerates healing of a canine tibial osteotomy ［J］. J Bone Joint Surg Am, 2004,86:1425-1438.

　　［9］ Rauch F, Lauzier D, Croteau S, et a1. Temporal and spatial expression of bone morphogenetic protein2, 4, and 7 during distraction osteogenesis in rabbits ［J］. Bone, 2000,27(3):453-459.

　　［10］ Campisi P, Hamdy RC, Lauzier D, et al. Overview of the radiology, histology,and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible ［J］. J Otolaryngol, 2002,31(5):281-286.

　　［11］ Mizumoto Y, Moseley T, Drews M, et a1. Acceleration of regenerate ossification during distraction osteogenesis with recombinant human bone morphogenetic protein7 ［J］. J Bone Joint Surg Am, 2003,85:124.