氧化型低密度脂蛋白对骨髓内皮前体细胞增殖、凋亡及NO分泌功能的影响
【关键词】 内皮祖细胞
Effect of oxidized lowdensity lipoprotein on proliferation, apoptosis, and NO secreting function of endothelial progenitor cells from bone marrow
【Abstract】 AIM: To study the effect of oxidized lowdensity lipoprotein(oxLDL) on the proliferation, apoptosis, and NO secreting function of endothelial progenitor cells(EPCs). METHODS: Bone marrow derived EPCs were isolated from bone marrow blood of swine by density gradient centrifugation, then oxLDL of different concentrations (group B, 5 mg/L; group C, 10 mg/L; group D, 20 mg/L) were added into culture medium to detect the effect of oxLDL on EPCs. MTT assay was used to detect the effect of oxLDL on the multiplication ability of EPCs. Flow cytometry was used to detect the apoptosis caused by oxLDL. Then NO content was measured in the cell culture medium by nitrate reductase method to find the injury of oxLDL on cells and cell functions. RESULTS: Compared with that in the control group, oxLDL inhibited the proliferation of EPCs （group B, 0.189±0.007; group C, 0.112±0.008; group D, 0.070±0.008） （n=8）, promoted the apoptosis of EPCs （group B, 18.35±0.08; group C, 24.22±0.07; group D, 40.37±0.13） （n=6）, and damaged the NO secreting function of EPCs. These effects were intensified with the increasing concentration of oxLDL (P<0.001). CONCLUSION: OxLDL can inhibit the proliferation of EPCs, damage the NO secreting function and promote the apoptosis of the cells. It had been seen that EPCs was scant in the blood of coronary artery disease patients. There may be some relationship between oxLDL and the deficiency of EPCs.
【Keywords】 endothelial progenitor cells; lipoproteins, LDL; nitric oxide
【摘要】 目的： 探讨氧化低密度脂蛋白（oxLDL）对骨髓内皮前体细胞（EPCs）增殖、凋亡及一氧化氮(NO)分泌功能的影响. 方法： 密度梯度离心法获得猪的骨髓EPCs，不同浓度oxLDL(B组5 mg/L，C组10 mg/L，D组20 mg/L）作用于EPCs，MTT法检测oxLDL对EPCs增殖能力的影响，流式细胞仪检测oxLDL对细胞的凋亡率的影响，硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO含量的变化，观察oxLDL对细胞及其功能的影响. 结果： 与对照组相比，oxLDL抑制EPCs增殖（B组0.189±0.007，C组0.112±0.008，D组0.070±0.008）（n=8)，促进EPCs的凋亡（B组18.35±0.08，C组24.22±0.07，D组40.37±0.13） （n=6），损伤细胞的分泌功能，作用随oxLDL浓度增大而增强(P<0.001). 结论： OxLDL抑制EPCs的增殖，损伤细胞分泌功能，促进细胞凋亡，与临床上观察到的冠心患者EPCs数量减少可能有一定的关系.
【关键词】 内皮祖细胞；脂蛋白类，LDL；一氧化氮
0引言
成体动物及人的外周血、骨髓中存在有内皮前体细胞（EPCs），它们是以CD133, flk1, CD31, Ⅷ因子［1-2］为标志的一群细胞，可以迁移、增殖并分化为成熟的内皮细胞，促进内皮的修复及出生后新生血管化的形成［3］. 新生血管化的形成可以改善心肌供血,并且阻止心肌梗塞区域疤痕组织的进一步形成［4］，从而改善心脏功能. 大量的研究已经证实，骨髓来源的EPCs有诱导缺血组织新生血管形成的潜力. 相反,高脂血症损伤新生血管和供应缺血区组织血运的侧支血管的形成. 氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在动脉粥样硬化的形成过程中起着重要的作用，我们研究oxLDL是否影响内皮前体细胞的增殖、凋亡及细胞功能，从而间接了解oxLDL对新生血管化的形成有何影响.
1材料和方法
1.1材料雄性小型猪2只，体质量（40±5） kg，由我校实验动物中心提供； PBS, Ficoll淋巴细胞分离液，胎牛血清（Gibco，美国），DMEM（Gibco，美国），VEGF及bFGF（AustraliaTBD Science，澳大利亚），10万U青霉素和100 mg/L链霉素，小鼠flk1、山羊属CD133（Santa Cruz，美国）、鼠CD31, FITC羊抗小鼠（IgG）、FITC羊抗兔（IgG）、罗丹明兔抗羊（IgG）（Zymed，美国）， NO, TBA试剂盒（南京建成，中国），LDL（Sigma，美国）， 6孔培养板（Nunclon，丹麦）; Elite ESP流式细胞仪(美国COULTER公司)，Olympus Tokyo CK相差显微镜（奥林巴斯），DG3022A型酶联免疫检测仪（南京华东管厂），UV2450分光光度计（日本SHIMADZU公司），MRC1024激光共聚焦显微镜（美国BioRad公司）.
1.2方法
1.2.1猪骨髓单核细胞的分离30 g/L浓度苯巴比妥1 mL/kg麻醉后，左侧髂后棘局部常规消毒铺巾，20 g/L利多卡因5 mL局麻，沿髂后棘行骨穿，有落空感后接肝素化的20 mL注射器用力抽吸. 抽出的细胞悬液经等体积DMEM混合重悬后，小心叠加于等体积淋巴细胞分离液上，保持界面清晰，2000 r/min, 离心20 min，吸取中间云雾层细胞，5倍体积DMEM重悬，1500 r/min, 10 min，洗涤两次. 末次离心后，弃上清，加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM重悬. 取微量细胞悬液与等体积2 g/L台盼蓝染液混合，进行细胞活力计数，死细胞被染成蓝色，活细胞不着色，活细胞数占98%以上. 细胞接种于培养瓶中，由于成纤维细胞贴壁较快，多于24 h内贴壁，故取24 h未贴壁细胞，经含100 mL/L胎牛血清、VEGF（10 μg/L）, bFGF（10 μg/L）的全培养液重悬后接种培养；部分细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中，细胞爬片48 h后进行鉴定.
1.2.2氧化低密度脂蛋白的制备低密度脂蛋白（LDL）购于Sigma公司，经PBS溶解后，与灭菌的CuSO4溶液（5 μmol/L）, 37℃孵育24 h. 对照含200 μmol/L EDTA无CuSO4同样条件孵育. 孵育中止后，氧化的LDL加EDTA至终浓度0.6 mmol/L中止氧化，在含200 μmol/L EDTA 的PBS溶液中透析24 h. 丙二醛的生成表明LDL被氧化，用TBA法检测丙二醛的生成. OxLDL中TBA浓度为（14.74±0.55） mmol/kg.
1.2.3实验分组细胞80%长满后，2.5 g/L胰蛋白酶消化，全培养液重悬呈单细胞悬液后，接种于96孔板及24孔板. 贴壁后，取对数生长期细胞分组： A组(对照组)加等量含200 μmol/L EDTA的全培养液；B, C, D组分别给予含oxLDL浓度为5, 10及20 mg/L的全培养液，37℃ 50 mL/L CO2孵箱孵育. 96孔板细胞孵育24 h后，每孔加MTT 5 g/L, 37℃继续孵育4 h，终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150 μL的DMSO后振荡10 min，酶联免疫检测仪，490 nm波长测各孔A值. 细胞培养24 h后，各取100 μL细胞培养液，用硝酸还原酶法测NO的分泌量，使用南京建成NO试剂盒，方法见说明书；24孔板培养细胞在oxLDL作用72 h后，2.5 g/L胰蛋白酶（含2 g/L EDTA）消化细胞中止后，送流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率.
1.2.4细胞鉴定激光共聚焦：细胞爬片48 h后，40 g/L多聚甲醛固定30 min后，PBS冲洗3次，干燥后分别按1∶75稀释flk1和CD133的一抗，及CD31和CD133的一抗进行双标，4℃冰箱，湿盒过夜后，吸除剩余的一抗，PBS冲洗后分别加入1∶100稀释的二抗进行双标，置入4℃冰箱，湿盒过夜，PBS冲洗后行激光共聚焦检测，结果见图1，2.
图1CD31和CD133（略）
图2flk1和CD133（略）
1.2.5数据处理与统计分析对实验组和对照组数据求其平均值和标准差，应用SPSS13.0进行数据统计，所用统计方法为方差分析，多重均数差异显著性检验采用LSDt检验.
2结果
2.1OxLDL对细胞增殖的影响经oxLDL作用24 h后，骨髓源性的EPCs的增殖能力与对照组（0.260±0.010）相比，不同浓度的oxLDL对EPCs增殖均有明显抑制作用，B组（0.189±0.007），C组（0.112±0.008），D组（0.070±0.008），且随浓度增加而抑制作用增强，两两之间比较差别均有统计学意义，P均<0.001 (n=8).
2.2流式细胞仪检测oxLDL对细胞凋亡的影响有报道EPCs本身就存在有自身凋亡的现象，在本实验中观察到72 h后对照组EPCs凋亡率为12.68±0.06，与对照组相比，不同组浓度的oxLDL对EPCs均有促凋亡作用，B组（18.35±0.08），D组（40.37±0.13），C组介于B, D组之间（24.22±0.07），以D组更为显著，不同浓度的oxLDL促凋亡作用组间差异均有统计学意义（P＜0.001），且随浓度增高而促凋亡作用增强(n=6).
2.3NO分泌量NO是一种有多种生物活性的物质，在心血管系统有许多重要的生理作用，其化学性质活泼，在体内代谢很快；NO分泌量是内皮细胞功能的标志，内皮功能障碍通常表现为NO分泌量的减少. 与对照组（176.33±0.74） μmol/L相比，不同浓度的oxLDL均可损伤EPCs的NO分泌量，随oxLDL浓度的增加，NO分泌量呈不同程度的减少，B组（159.10±0.19） μmol/L, C组（129.95±0.11） μmol/L, D组（81.64±0.07）μmol/L分别与对照组相比P值均<0.001(n=6)，表明细胞功能也受到了不同程度的损害.
3讨论
在Asahara等1997年发现循环内皮前体细胞之前，临近损伤部位的内皮细胞局部迁移和增殖被认为是内皮修复的主要机制. 近来研究表明出生后新生血管化并不单纯依赖于已存在血管的出芽生长方式，而与循环外周血及骨髓中的EPCs细胞关系密切［1-2］. 有作者已从外周血和骨髓中分离出EPCs，并证实可以增加缺血组织的新生血管化［3］. 而循环血中的EPCs来源于骨髓，具有分化成ECs，修复损伤内膜、形成新生血管的特性，因此其在冠心病中的巨大潜力愈来愈受到关注. 最近有组织证实在动物及人的研究中，EPCs在新形成的血管内皮细胞中占25%［5］.
大量的动物试验和临床研究都表明外周血中EPCs数目和冠心病的众多危险因素之间存在着密切的关系［6］. 有研究表明，从1型糖尿病患者血中分离出的EPCs经培养后，与年龄和性别匹配的对照相比较降低了44%［7］. 急性心梗后骨髓单核细胞局部注射可以通过诱导VEGF的形成，而减少心肌梗死的面积［8］. 对缺血心肌局部供应成血管细胞配体及生长因子等均可提高骨髓单核细胞移植后侧支灌注及局部区域的心脏功能［9］.
依据EPCs能够促进出生后新生血管化这一理论，考虑用EPCs作为增加缺血组织新生血管化的一个新的潜在的细胞疗法，因此对调节EPCs生物活性的机制进一步了解，可以对新生血管化的发生机理提供新的线索. 最近，有研究表明动脉粥样硬化的危险因素与EPCs的数量呈负相关［7］，而oxLDL是动脉粥样硬化形成的一个重要因素. OxLDL可以阻止VEGF诱导的EPCs分化［10］，促进其老化，导致细胞功能失调［11］，但这方面研究还是比较少.
在本研究中，我们用不同浓度的oxLDL作用于EPCs，观察对细胞的增殖、凋亡及分泌NO功能的影响. OxLDL可以促进细胞凋亡，损伤EPCs的增殖能力及细胞NO分泌功能. 内皮功能障碍在各种心血管疾病中发挥重要的作用，被认为是伴随着并使许多心血管疾病恶化的重要临床综合征. 对EPCs的损害必然影响其参与血管内皮的修复及进行生成新生血管化的能力. 使我们进一步认识到高胆固醇血症不仅可以损伤血管内皮，而且同时可以使EPCs数量减少促进其凋亡，使血管的损伤与修复能力间失去平衡，进一步促进冠心病的进展，同时也影响EPCs参与新生血管化. 因此临床进行抗oxLDL治疗可以抵抗其诱导EPCs的凋亡及数量的减少，改善EPCs功能，从而有利于血管内皮的修复及新生血管的形成. .
【文献】
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