硫辛酸对细胞DNA损伤保护作用的初步研究
【关键词】 过氧化氢
Preliminary investigation on protective function of lipoic acid from DNA damage
【Abstract】 AIM: To the study doseeffect relationship between the DNA damage of HepG2 cells and the effect of different concentrations of hydrogen peroxide (H2O2) for 2 h respectively, and to observe the protective function of lipoic acid from the DNA damage of cells at the same time. METHODS: HepG2 cells were divided into control group, damage group and protective group, then were added with different concentrations of H2O2 and lipoic acid. Two hours later, the single cell gel electrophoresis (SCGE) was used to detect the DNA damage. RESULTS: The DNA damage of cells was more serious with H2O2 concentration increasing. The tail length, the tail DNA content and the tail moment significantly increased (P<0.05）. Lipoic acid could significantly decrease the tail length, the tail DNA content and the tail moment of damaged cells （P<0.05）. CONCLUSION: H2O2 causes DNA damage of cells in a doseeffect manner, while lipoic acid can reduce effectively this DNA damage caused by H2O2.
【Keywords】 hydrogen peroxide; DNA; comet assay; thioctic acid
【摘要】 目的： 用单细胞凝胶电泳技术（SCGE）研究不同浓度过氧化氢（H2O2）分别作用于HepG2细胞2 h后DNA损伤的剂量效应关系，同时观察硫辛酸对H2O2损伤细胞DNA的保护作用. 方法： 将细胞分为对照组、损伤组和保护组，依次加入不同浓度的H2O2及硫辛酸，应用SCGE检测H2O2引起细胞DNA损伤. 结果： 随着H2O2浓度的增加，细胞DNA的损伤程度加重，能使尾长、尾部DNA百分含量和尾距显著增加（P<0.05）. 硫辛酸能使H2O2损伤细胞的尾长、尾部DNA百分含量和尾距均较对照组减少（P<0.05）. 结论： H2O2对细胞DNA损伤具有剂量效应关系，硫辛酸可以有效地减少H2O2引起的细胞DNA的断裂损伤.
【关键词】 过氧化氢；DNA；慧星试验；硫辛酸
0引言
体内自由基代谢异常可以导致细胞DNA损伤，过氧化氢(H2O2)是自由基代谢过程中的一个重要中间产物，在引起细胞DNA损伤过程中具有重要作用. 硫辛酸作为一种有效的抗氧化剂，能抑制自由基对细胞的损伤［1］. 本研究利用可以快速、灵敏检测出细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳技术（SCGE）来研究不同浓度H2O2分别作用于HepG2细胞2 h后DNA损伤的剂量效应关系，同时观察硫辛酸对H2O2损伤DNA的保护作用，从而为探讨细胞DNA损伤的机理提供直接证据，并筛选出有效的抗细胞DNA损伤的抗氧化剂.
1材料和方法
1.1材料HepG2细胞系（本校病教研室惠赠），正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、溴化乙锭(Sigma公司），其他试剂均为进口或国产分析纯试剂.
1.2方法将肝癌细胞株HepG2接种于12孔培养板中，分为对照组、损伤组和保护组3组，当细胞长至80%~90%融合时（约24 h）损伤组分别加入H2O2，使其终浓度为0, 10, 100, 500, 1000, 2000 μmol/L，保护组分别加入H2O2和硫辛酸，H2O2的终浓度为500 μmol/L，硫辛酸终浓度为37.5 μmol/L, 37℃培养2 h后消化细胞，加入PBS离心两次后，用PBS将细胞浓度调至1×106/L，放置于37℃水浴锅中备用. 每组细胞经台盼蓝染色，细胞存活率均大于90%. 单细胞凝胶电泳方法参照Singh等［2］方法略加改进后进行. 主要步骤 ① 铺片： 第一层将正常熔点的琼脂糖凝胶100 μL铺于载玻片；第二层将细胞悬液（细胞浓度为1×106/L）50 μL和低熔点的琼脂糖凝胶450 μL在37℃下混合，每张片子加80 μL混合液，4℃放置10 min；第三层将低熔点的琼脂糖80 μL铺于上述片子，4℃放置10 min. ② 裂解： 载玻片放入细胞裂解液（2.5 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris, 100 mmol/L Na2EDTA, 10 mL/L肌氨酸钠 ,临用前加入10 mL/L TritonX100, 100 mL/L DMSO, pH=10），4℃裂解1.5 h. ③ 电泳： 载玻片置入新鲜电泳液（300 mmol/L 乙酸钠，100 mmol/L Tris, 100 mmol/L Na2EDTA, pH=10），静置20 min，电压15 V，电流300 mA,电泳1 h. ④ 中和、染色： 预冷的Tris缓冲液（0.4 mmol/L, pH=7.4），中和30 min,滴加EB（15 mg/L） 40 μL,加盖玻片，荧光显微镜下观察采集照片. ⑤ 分析： 每组各选30个细胞，应用CASP （Comet assay software project）尾长、尾部DNA百分含量和尾矩.
统计学处理： 采用SPSS10.0统计软件包，统计方法采用KruskalWallis检验比较各组间尾部DNA含量、尾长及尾距的差异，以P<0.05为有统计学差异，在各组间比较的基础上，用MannWhitney μ检验进行各组间两两比较，此时检验水准α调整为0.003.
2结果
2.1H2O2损伤的剂量效应关系随着H2O2浓度的增加，各指标数值逐渐增大（图1，2），对照组与H2O2各剂量组之间尾长、尾部DNA百分含量和尾距差异均有显著性（P<0.025）；H2O2各剂量组之间各指标也具有显著性差异（P<0.025，表1）.
图1500 μmol/L H2O2处理的细胞×400（略）
2.2硫辛酸对H2O2致DNA损伤的保护作用与对照组（单纯H2O2 500 μmol/L处理2 h, 图3）相比较，硫辛酸处理组（H2O2 500 μmol/L，硫辛酸37.5 μmol/L 处理2 h， 图4）尾部DNA各指标减小，差异具有显著性（P<0.05，表2）.
图21000 μmol/L H2O2处理的细胞×400（略）
表1H2O2作用2 h的HepG2细胞尾部DNA变化（略）
aP<0.05 vs对照组.
图3对照组细胞×400（略）
图4硫辛酸处理组×400（略）
表2HepG2细胞经H2O2和硫辛酸共同处理后细胞尾部DNA变化（略）
vs对照组.
3讨论
DNA在生物学和医学中起着十分重要的作用，它带有生物信息编码，能够控制多种生物功能，包括蛋白质的合成和遗传的性状等等. 自由基能使DNA双链断裂和单链断裂，使DNA的碱基变成自由基，并生成稳定的氧化产物，常态下，细胞每消耗200个分子氧就会产生1分子氧化核酸. 因此，体内自由基代谢异常会导致细胞DNA损伤. H2O2是体内自由基代谢过程中一个重要的中间产物，在引起细胞DNA损伤过程中起着非常重要的作用，我们采用单细胞凝胶电泳技术检测到这种损伤对于H2O2在一定范围内有剂量依赖关系. 单细胞凝胶电泳是一种有效的检测细胞DNA损伤的方法，它利用断裂的DNA碎片在强碱条件下，从DNA的超螺旋结构中释放出来，在电泳时移向阳极的特点，并在荧光染色后可在显微镜下观察到尾部朝向阳极的彗星样影像来对损伤的DNA进行检测［3］.
损伤强度与细胞DNA的尾长、尾矩及尾部DNA含量呈正相关. 本实验中随着H2O2浓度增加，细胞DNA的尾长、尾矩及尾部DNA含量显著增加（P<0.05）. 由此可推测，当体内自由基累积造成损伤时，它对于细胞DNA的损伤可能在一定范围内呈现剂量效应关系，但体内是一个复杂的环境，与体外研究有着很大的区别，其造成DNA损伤情况还有待于进一步研究. 这将为研究抗氧化药物以及药物剂量提供重要实验依据.
硫辛酸作为体内发现的一种重要的抗氧化剂是一种八碳羧酸，存在于α酮酸脱氢酶复合体中，该酶复合体由三种酶复合而成：α酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶. 其中二氢硫辛酸转酰基酶促使酰基转移给辅酶A生成酰基辅酶A. 硫辛酸是体内ATP产生过程中必不可少的辅因子，参与三羧酸循环，它能有效地对抗多种自由基，并可调节其他抗氧化剂，对机体有重要的保护作用［4］. 硫辛酸可以增强维生素C及维生素E的效力，所以硫辛酸的存在对于抗氧化具有加乘的效果. 而且补充硫辛酸也能加强其他抗氧化剂如维生素C, E及CoQ10等的利用率，能够增强整体的抗氧化能力，尤其，能对抗线粒体利用氧气时所产生的自由基，是最佳的线粒体抗氧化剂. 它具有脂溶与水溶的双重特性，可以进入细胞的脂相与水相部分，在任何部位清除自由基，发挥“全能抗氧化剂”的作用［5］. 本实验中，硫辛酸对由于H2O2造成的细胞DNA氧化损伤具有明显的保护作用，处理组细胞尾长、尾部DNA百分含量和尾矩均较对照组明显减少（P<0.05），证明硫辛酸可以有效地减少H2O2引起的细胞DNA的断裂损伤. 我们的研究表明，在体外硫辛酸可以有效对抗细胞DNA氧化损伤. 但是，硫辛酸发挥保护作用的有效剂量以及在体内的作用机制还有待于进一步的研究.
【】
［1］ Sethumadhavan S, Jayavelu T, Muthuswamy A, et al. Oxidative stress on mitochondrial antioxidant defense system in the aging process: Role of DLαlipoic acid and Lcarnitine ［J］. Clin Chim Acta, 2005,355(12):173-180.
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