兔骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养体内成软骨的实验观察

【关键词】  软骨细胞

    Experimental study on chondrogenesis by coculture of rabbit mesenchymal  stem cells and chondrocytes

　　【Abstract】 AIM: To explore the feasibility of in vivo chondrogenesis by coculture of mesenchymal stem cells (MSCs) and chondrocytes. METHODS: Rabbit MSCs and chondrocytes were in vitro isolated, cultured and expanded respectively and then were mixed at a ratio of 3∶1 (MSCs∶chondrocytes). The mixed cells were seeded onto PGA scaffold at the ultimate concentration of 6.0×1010/L as coculture group. MSCs and chondrocytes of the same ultimate concentration were seeded respectively onto the scaffold as negative control group(MSCs group)and positive control group(chondrocyte group). Then, the cellscaffold constructs were transplanted into subcutaneous tissue of adult rabbits. All specimens were harvested after in vivo culture for 8 weeks. Gross observation and histology were used to evaluate the new cartilage. RESULTS: Cells in all groups had a fine adhesion to the scaffold. In both coculture group and positive control group, the cellscaffold constructs could maintain the original size and shape during in vivo culture and formed homogenous mature cartilage after 8 weeks of in vivo culture. Furthermore, the neocartilages in both groups were similar to each other in gross appearance and histological features. In negative control group, the cartilage was not formed but the connective tissue. CONCLUSION: Chondrocytes can provide a chondrogenic microenvironment to induce a chondrogenic differentiation of MSCs and thus promote the chondrogenesis of MSCs in vivo.

　　【Keywords】 chondrocytes;  MSCs;  coculture;  PGA

　　【摘要】 目的：探讨骨髓基质干细胞（MSCs）与软骨细胞混和培养体内成软骨的可行性. 方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞，二者按一定比例混和（3∶1），以6.0×1010/L的细胞密度接种于PGA（聚羟基乙酸）支架作为共培养组，以相同密度的单纯MSCs和单纯软骨细胞分别接种以作为阴性与阳性对照. 将细胞PGA材料复合物种植在成兔皮下，各标本于体内培养8 wk时取材，通过大体观察、组织学等方法对新生软骨进行初步评价. 结果：各组细胞与PGA支架的黏附良好. 混和培养组及阳性对照组(软骨细胞组)体内培养8 wk后均形成了成熟的软骨组织,并基本保持了复合物初始的大小和形状,两组新生软骨外观及组织学特征基本相同. 阴性对照组(单纯MSCs组)在体内培养过程中未形成软骨组织，而是形成了纤维结缔组织. 结论：软骨微环境在MSCs成软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用，软骨细胞能有效地诱导MSCs向软骨细胞分化并促进MSCs体内软骨形成.

　　【关键词】 软骨细胞；骨髓基质干细胞；共同培养；PGA

　　0引言

　　软骨缺损与损伤一直是外科临床的难题，组织工程技术为软骨缺损的修复提供了新方法［1］. 目前多采用自体软骨细胞移植修复软骨缺损［2］，但效果并不理想. 骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有多向分化潜能的干细胞，在体外特定的诱导条件下可分化为骨、软骨等组织［3-4］. 诱导因子及软骨微环境是影响MSCs成软骨分化及软骨形成的主要因素. 我们利用少量软骨细胞，通过共培养方法诱导MSCs在体内形成成熟的软骨组织，为进一步的实验研究提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料新西兰兔15 只，5～6 mo龄， 雌雄不限，体质量(2.5±0.5) kg；新生新西兰兔2只（第四军医大学实验动物中心）；DMEM培养液、胎牛血清（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；II型胶原酶（Promega）；PGA（上海易括公司）；倒置显微镜（IX71，Olympus）；CO2孵箱（日本三洋，MCO175型）.

　　1.2方法

　　1.2.1兔MSCs的分离培养将出生1～3 d的新西兰兔处死，无菌操作下取其四肢的长骨，用注射器抽取长骨内骨髓，加含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基吹打制成单细胞悬液，分装于2个25 mL培养瓶中，取少量细胞计数. 在37℃, 5 mL/L CO2及饱和湿度条件下静止培养5 d. 第6日首次细胞换液，以后每2～3日换液1次. 待第10～14日贴壁细胞长满瓶底部后用2.5 g/L胰蛋白酶和1 mL/L EDTA的混合溶液消化并传代培养细胞.

　　1.2.2兔软骨细胞的分离与培养将出生1～3 d的新西兰兔处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取出软骨，将软骨切成1～3 mm3大小置无菌试管，PBS冲洗3次，800 r/min离心3 min，吸去PBS，加2 g/L胰酶4 mL，置5 mL/L CO2孵箱30 min，吸出胰酶后再加入2 g/L II型胶原酶5 mL，置孵箱内消化6~8 h. 观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800 r/min离心3 min，用培养液洗2次. 细胞记数后移入25 mL培养瓶中，使细胞密度为2×104/L，加DMEM培养液(含100 mL/L胎牛血清，1×105 U/L青霉素，50 mg/L维生素C，0.15 g/L谷氨酰胺)，于37℃，5 mL/L CO2孵箱中培养，每2日换液1次. 原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养.

　　1.2.3聚羟基乙酸（PGA）支架的处理PGA无纺网支架材料的纤维直径15 μm，平均间距150～200 μm，孔隙率97%，厚2 mm. 将PGA支架切成5 mm×5 mm大小，750 mL/L乙醇浸泡12 h，无菌PBS冲洗3遍，放入90 mm无菌培养皿中干燥，用前用紫外线照射30 min.

　　1.2.4细胞与PGA支架的复合将MSCs与软骨细胞按3∶1比例混匀，调整细胞密度为6.0×1010/L. 将混合细胞、软骨细胞及MSCs分别接种于经培养液预湿的塑形PGA上，以细胞悬液刚好不溢出材料为宜. 在37℃，5 mL/L CO2，饱和湿度培养箱中孵育4 h，然后在复合物周围滴加含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液4 mL，继续孵育4 h，再加入10～15 mL培养液，以后每48 h换液1次，培养1 wk. 倒置显微镜下观察细胞生长及附着情况.

　　1.2.5实验分组及复合物种植实验分为A，B，C 3组，每组各5只. 3组分别接种细胞密度为6.0×1010/L的混和细胞、软骨细胞和MSCs. 将兔麻醉后背部一侧脱毛，无菌条件下切开皮肤，适当分离切口一侧皮下组织，将细胞PGA复合物种植于远离切口的皮下.

　　1.2.6组织学评价在细胞PGA材料复合物种植后第8周取材，行大体标本观察和HE，Masson三色染色检查，对工程化软骨进行组织学评价.

　　2结果

　　2.1细胞形态观察①MSCs培养: MSCs呈纺锤形或梭形，原代呈集落样生长，接种后8～10 d可达80%以上的融合，此时细胞相互间紧密贴附，单个细胞呈狭长梭形，从整体看大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列. 传代培养后细胞不再以集落方式生长，而是以均匀分布的纺锤形细胞形态平均生长(图1A). ②软骨细胞培养: 原代细胞一般12～24 h贴壁，48 h后开始增殖. 细胞刚贴壁时仍为圆形，伸展后呈多角形，多以类似于同源细胞群的生长方式形成小群体，中央密集处可形成软骨样结节. 5 d左右即可达到90%以上的融合(图1B).

　　图1第二代兔MSCs(A)和软骨细胞（B）×40（略）

　　2.2大体观察种植后伤口及种植区未见感染和种植物排出. 第8周时，A，B组的种植区触之有片状硬块，取出标本见其外包裹一层结缔组织，剥去结缔组织后标本大小与植入前相当，呈瓷白色软骨样结构，弹性感明显，但钳夹易碎. C组种植区取出为一纤维结缔组织团块，未见软骨样结构.

　　2.3组织学观察HE染色见A组(图2A)及B组（图2B）的组织学特征较接近，软骨细胞大部分成熟,包埋在陷窝内, PGA 纤维已消失,炎细胞浸润不明显；C组以纤维组织为主. Masson三色见A组（图3A）及B组（图3B）胶原深染,并可见软骨陷窝；C组则着色极浅.