褪黑素对急性睡眠剥夺大鼠行为的影响及机制

                       作者：刘芳娥，刘利兵，陈健康，陈志扬，杨芳，化前珍，曲萍

【关键词】  褪黑素

    Effect of melatonin on behavior of rats of acute sleep deprivation and its working mechanism

    LIU FangE1,LIU LiBing1,CHEN JianKang1,CHEN ZhiYang1,YANG Fang1,HUA QianZhen2,QU Ping1

    1Center of Basic Medicine Teaching Experiment, School of Basic Medicine, 2School of Nursing, Fourth Military Medicine University, Xian 710033, China

    【Abstract】 AIM: To explore the effect of melatonin (MT) on the behavior of rats with acute sleep deprivation (SD) and the related biomechanism. METHODS:  Twentyfour Sprague Dawley rats were divided into 3 groups: control group (SD + sodium chloride), experimental group 1 (SD + MT, 5 mg/ kg) and experimental group 2 (SD + MT, 15 mg/ kg). The rats were injected intraperitoneally with MT or sodium chloride one time a day for 1 week. SD was induced in the rats housed on small platform over water. After 72 h SD, the rats behavior was measured by "open field test" and then malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) contents in cerebral cortex and hippocampus of the rats were measured by TBA and Griess method respectively. RESULTS:  The excitability and explorative behavior of the 2 experimental groups in the "open field" significantly decreased compared with those of the control group (P<0.05,  P<0.01). There was a doseeffect relationship in the experimental groups. The contents of NO or MDA in cerebral cortex and hippocampus of the experimental groups were lower than those of the control group（P<0.01）. CONCLUSION:  Melatonin depresses the excitability in the rats of acute sleep deprivation, possibly by inhibiting the increase of NO and MDA in cerebral cortex and hippocampus of the rats.

    【Keywords】 melatonin; sleep deprivation; behavior; NO; MDA

    【摘要】 目的：探讨褪黑素对急性睡眠剥夺（SD）大鼠行为的影响及可能的作用机制. 方法：将Sprague Dawley 24只大鼠随机分为3组，对照组给予SD和生理盐水腹腔注射，2个实验组分别给予SD和褪黑素5 mg/kg和15 mg/kg腹腔注射，连续给药7 d后，采用小平台水环境法建立大鼠SD模型，SD 72 h用旷场反应箱测试大鼠的行为，用试剂盒检测大鼠大脑皮层和海马中一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）含量. 结果：实验组旷场反应测试大鼠兴奋性和探索性行为均明显小于对照组（P<0.05, P<0.01），有量效关系. 实验组大鼠大脑皮层和海马组织中NO和MDA含量明显低于对照组（P<0.01）. 结论：褪黑素对睡眠剥夺大鼠行为障碍有改善作用，这种作用可能与抑制睡眠剥夺大鼠大脑皮层和海马中NO及MDA的升高有关.

    【关键词】 褪黑素；睡眠剥夺；行为；一氧化氮；丙二醛

    0引言

    睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）不但可引起动物或人产生疲劳、情绪不良、思维紊乱、甚至抵抗力低下、而且能引起学习记忆受损和行为的改变. 随着社会的，人们的生活节奏越来越快，睡眠剥夺现象日益常见. 因此，探讨减少睡眠剥夺对机体不良影响的措施具有十分重要的意义. 本实验拟研究褪黑素对睡眠剥夺大鼠行为的影响及可能的作用机制，为睡眠剥夺引起的行为障碍的防治提供理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1实验动物上海产Sprague Dawley大鼠24只，成年、雄性、健康，体质量(180±15) g(第四军医大学实验动物中心提供). 将24只大鼠随机分为3组，每组8只. 对照组：睡眠剥夺+生理盐水；实验1组：睡眠剥夺+小剂量褪黑素；实验2组：睡眠剥夺+大剂量褪黑素.

    1.1.2药品和仪器睡眠剥夺装置参照［1］自制，旷场反应箱，秒表，褪黑素（Sigma公司，使用前需少量乙醇助溶，以生理盐水配制成所需浓度，终溶液中乙醇量<50 mL/L），MDA试剂盒，NO试剂盒，离心机，721分光光度计，恒温水浴箱等. 所有试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.

    1.2方法

    1.2.1给药实验1组和实验2组于每日17：00腹腔注射褪黑素，剂量分别为5 mg/kg和15 mg/kg配制成2 mL溶液，给药，对照组在相同时间腹腔注射生理盐水2 mL，连续7 d，然后给予睡眠剥夺3 d. 睡眠剥夺期间，依然按分组每日给予褪黑素或生理盐水.

    1.2.2建立睡眠剥夺模型采用小平台水环境法（flower pot）建立大鼠SD模型. 制作30 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，其中有一直径为6.3 cm，高8.0 cm的平台，在平台周边注满水，水温保持在20℃左右，水面距平台面约1.0 cm. 鼠在平台上可自行进食饮水. 若其睡眠，则由于肌肉张力松弛而落入水中，大鼠只能重振精神爬上平台，如此反复达到SD的效果. 大鼠活动空间内持续40 W日光灯照射，室内温度控制在18℃～22℃. 睡眠剥夺前，让大鼠熟悉适应环境7 d，即在给予大鼠褪黑素或生理盐水腹腔注射的同时，将大鼠放在没有注水的睡眠剥夺箱内，让其熟悉睡眠剥夺环境. 而后进行睡眠剥夺72 h.

    1.2.3行为学测试用旷场反应箱测试大鼠的行为变化和情绪兴奋性. 将旷场反应箱放置在一个较封闭的屋内，有照明装置可调节光线强弱. 旷场反应箱为一个底部面积100 cm×100 cm，上口面积120 cm×120 cm，高30 cm的方形容器，底面小上口大，便于观察大鼠在箱内的活动，旷场反应箱正上方有一个摄像头监视大鼠的活动，并可将实验数据和图像信息输入机. 观察大鼠在旷场反应箱中5 min内的运动，并观察动物情绪变化、修饰行为（如洗脸行为、抓挠行为）和大小便次数. 每只大鼠在睡眠剥夺72 h后测量1次，每次测试后，用稀硫酸溶液清洗旷场周壁及底面，以免上次动物余留的信息（如大鼠的大、小便、气味）影响下次测试结果.

    1.2.4海马、大脑皮层内NO，MDA测定取上述各组睡眠剥夺结束后大鼠立即处死，于冰浴中取出海马与大脑皮层. 分析天平称质量, 按质量海马加冰冷的100 mL/L PBS溶液(pH 7.0) 稀释至10%，大脑皮层加冰冷的生理盐水稀释至10%，并以玻璃匀浆器匀浆, 1000 r/min，离心5 min后沉淀，取上清液均置于冰箱中待测. 根据试剂盒的操作步骤，采用硝酸还原法检测NO，硫代巴比妥酸法检测MDA. 由专人一次检测完成.统计学处理：所有数据以x±s表示，结果采用SPSS 10.0软件包进行方差分析，均数间的多重比较用LSDt进行显著性检验.

    2结果

    2.1大鼠兴奋性和探索性褪黑素对大鼠行为的影响测试显示，随给药剂量不同，大鼠的情绪状况有一定差异：2个实验组比对照组，小剂量组比大剂量组，大鼠的修饰行为和大小便次数均明显减少，实验组更易受激惹. 在旷场反应箱中，运动总距离（total distance，TD）表示大鼠在旷场反应箱中5 min内运动的总路程，较快运动距离（quick speed distance, QSD）表示大鼠速度大于5 cm/s时运动的总路程. 实验中用运动总距离和较快运动距离表示大鼠的行为兴奋性，运动总距离和较快运动距离越大，说明大鼠的兴奋性越高.离开边界总距离(leave border distance，LBD)表示大鼠不沿边界运动时的总路程，即离开边界15 cm时运动的距离；内环内距离（inner toriod distance，ITD）表示大鼠在内环内部运动的总路程，内环是指以旷场中心点为圆心，以44 cm为半径的圆. 用离开边界总距离和内环内距离表示大鼠的探索性行为，离开边界总距离和内环内距离越大，说明大鼠的探索性行为越多(表1).

    表1褪黑素对睡眠剥夺大鼠的行为的影响(略)

    2.2睡眠剥夺大鼠大脑皮层和海马NO和MDA含量褪黑素对睡眠剥夺大鼠大脑皮层和海马NO和MDA含量的影响（表2）.

    表2褪黑素对睡眠剥夺大鼠大脑皮层和海马NO和MDA的影响(略)

    3讨论

    SD是一种特殊的生理心理状态，它可引起机体生理、心理功能的改变. 已有动物实验表明［2］SD 24 h和48 h时动物表现最为活跃，而12，72和96 h时兴奋性较弱，说明若睡眠剥夺时间短，情绪状态表现为兴奋，72 h以后则有抑制趋势. 本实验结果与上述结果有所不同，SD 72 h后，对照组大鼠比实验组大鼠大小便次数增多，修饰行为或“洗脸”行为增多，对于给它的刺激敏感、易怒，实验后将它放入饲养笼中，对其他鼠进攻行为也增多. 这说明，大鼠仍处于较兴奋的状态. 这与Youngblood等［3］的报道结果较一致，他的研究认为在48和72 h睡眠剥夺后大鼠游泳行为增加. 据报道［4］修饰行为常发生于产生矛盾或害怕的情境中，大鼠SD后精神行为表现出一定的兴奋性，修饰行为增多，说明SD环境使大鼠情绪非常紧张恐惧，攻击行为增多. 本实验结果提示褪黑素对睡眠剥夺引起的情绪兴奋有抑制作用.本研究在旷场试验中用运动总距离和较快运动距离指标考察大鼠的兴奋性状态. 大鼠在旷场反应箱中，由于环境陌生，常表现为恐惧、紧张、好奇等，基本上处于运动状态. 运动速度大于5 cm/s时，大鼠处于行走或跑步的状态；运动速度小于5 cm/s时，大鼠在缓慢移动，即处于相对“静止”状态. 因此，用运动总距离和较快运动距离表示大鼠的运动量，代表其兴奋性状态. 实验结果显示，实验1组和实验2组与对照组相比，运动总距离和较快运动距离都显著减少，说明褪黑素对睡眠剥夺大鼠的行为兴奋性有明显的抑制作用，而且褪黑素的剂量越大，抑制作用越强. 实验用离开边界总距离和内环内距离两个指标考察大鼠的探索性行为. 人或动物在情绪兴奋或烦躁时，就会导致行为的目的性减弱，注意力不集中，对安全的考虑减少，对危险的防范意识降低. 因此，大鼠在72 h睡眠剥夺后，行为兴奋，注意涣散，违背本能，离开边界运动的总距离和内环内运动总距离明显增多. 本实验结果显示，两个实验组与对照组比较离开边界总距离和内环内距离明显减少，表明褪黑素对睡眠剥夺大鼠的探索性行为也有抑制作用，但是大、小剂量之间无统计学意义.研究发现［5］，睡眠剥夺组大鼠脑组织NO含量升高，其中额叶及海马NO含量升高更明显. 而且随着SD时间的延长，NO含量升高越明显. 丙二醛（MDA）是体内脂质过氧化的产物，其含量高低间接反映自由基对生物大分子的损伤程度. 褪黑素是一种内分泌激素，为体内抗自由基、抗氧化作用很强的活性物质. 褪黑素在预防皮层功能紊乱，如运动、感觉、记忆和心理损伤方面是非常有用的［6］. 我们研究表明，2个褪黑素实验组大鼠大脑皮层和海马NO和MDA的含量明显低于对照组，提示褪黑素对睡眠剥夺大鼠大脑皮层和海马组织中NO和MDA的含量的升高有显著的抑制作用. 据报道［7］，褪黑素对中枢神经兴奋性的抑制机制可能通过抑制一氧化氮合酶，使谷氨酸受体激活产生NO水平下降而起作用. 说明MT抑制NO及MDA的升高作用，即抗自由基和抗过氧化损伤作用，可能是其发挥改善睡眠剥夺大鼠行为障碍的重要作用机制之一.

    【】

［1］ Youngblood BD，Zhou J, Smagin GN, et al. Sleep deprivation by the "Flower Pot" technique and spatial reference memory［J］. Physiol Behav, 1997,61(2):249-256.
［2］ 宋国萍,皇甫恩,苗丹民，等. 睡眠剥夺对大鼠学习和行为的影响［J］.第四军医大学学报, 2000,21(6):663-666.
［3］ Youngblood BD，Smagin GN，Elins PD，et al．The effects of paradoxical sleep deprivation and valine on spatial learning and brain 5HT metabolism［J］．Phsiol Behav, 1999，67(5)：643-649．
［4］ Brady K, Brown JW，Thurmond JB. Behavioral and neurochemical effects of dietary tyrosine in young and aged mice following coldswim stress［J］. Pharmacol Biochem Behav, 1980,12(5):667-674.
［5］ 吴兴曲,杨来启,王晓峰,等. 睡眠剥夺对大鼠一氧化氮和一氧化氮合酶的影响［J］. 临床心杂志，2002,10(2): 106-107.
［6］ Takashi Kondoh,Hisayuki Uneyama,Hitoo Nishino, et al. Melatonin reducea cerebral edema formation caused by transient forebrain ischemia in rats［J］. Life Sci,2002,72:583-590.
［7］ 汤业磊，潘以正. 褪黑素对FeCl3致痫大鼠行为及脑电图的影响［J］.中国临床神经,2003,11(1):42-45.