EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能
【关键词】 EBNA2
Construction of eukaryotic expression vector of EBNA2 and functional detection of its product
【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of EBNA2 and to express it in eukaryotic cells and detect the function of its product. METHODS: EBNA2 gene was obtained by PCR and DNA recombination from the plasmid pSG5EBNA2. PCR product of EBNA2b was then inserted into plasmid pMD18T and sequenced. The full length EBNA2 gene was cut and inserted into eukaryotic expression plasmid pCMVHA. Using LipofectamineTM 2000, the plasmid pCMVEBNA2 was transfected into Cos7 and then detected by Western blot and immunofluorescence. The activity of EBNA2 was detected by luciferase reporter assay. RESULTS: The EBNA2 gene was successfully cloned and its sequence was identical to that in GenBank. After plasmid pCMVEBNA2 was transfected into Cos7, the expressed product of EBNA2 was detected by Western blot and immunofluorescence. The transcriptional activity of EBNA2 was demonstrated by reporter assay. CONCLUSION: The eukaryotic expression vector pCMVEBNA2 has been successfully constructed and successfully expressed in eukaryotic cell line. The EBNA2 protein has transcriptional activation.
【Keywords】 EBNA2; clone; expression; genetic vector
【摘要】 目的： 构建EB病毒核心抗原2（EBNA2）的真核表达载体，在真核细胞中表达,并检测其表达产物的功能. 方法： 应用DNA重组和PCR方法从质粒pSG5EBNA2中亚克隆EBNA2的编码基因，插入到真核表达载体pCMVHA中. 应用脂质体的方法将重组质粒pCMVEBNA2瞬时转染Cos7细胞，通过Western blot和免疫荧光方法检测EBNA2的表达. 应用荧光素酶报告实验检测EBNA2蛋白的活性. 结果：克隆EBNA2的编码基因，经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致. 以含有EBNA2编码基因的真核表达载体瞬时转染Cos7细胞，EBNA2基因的表达产物通过Western blot和免疫荧光方法得到证实. 荧光素酶报告实验显示所表达的蛋白具有转录激活活性. 结论：成功构建EBNA2的真核表达载体，证实其在真核细胞Cos7可以表达，并具有转录激活功能.
【关键词】 EBNA2基因；克隆；表达；遗传载体
0引言
EB病毒核心抗原2（EBNA2）的编码产物是EB病毒体外感染细胞时最先表达的蛋白 ，作为一种转录因子，它可以调节病毒及细胞内多种基因表达，如LMP1，LMP2A［1］，CD21，CD23及cmyc等，同时还可以抑制细胞免疫球蛋白重链的转录. Notch信号途径是体内一个非常保守的信号途径，在体内分布十分广泛［2］. EBNA2可以与Notch信号途径中的重要分子RBPJκ相结合，激活下游靶基因，并通过模仿Notch信号途径对体内淋巴细胞的分化和发育方向起调控作用［3］. 同时EBNA2还可以促进抑癌分子p53的磷酸化［4］，调节癌基因的表达. 我们对EBNA2基因进行了克隆，并在真核细胞中表达，为进一步探讨其对小鼠免疫系统发育过程的影响奠定基础.
1材料和方法
1.1材料大肠杆菌XL10；质粒载体pCMVHA，pBluscript（-），pGA9816为本室保存. 载体pMD18T购自TaKaRa公司. Cos7细胞为本室保存. 脂质体LipofectamineTM 2000及细胞培养试剂均购自Invitrogene公司. 抗EBNA2抗体购自Dako公司，HRP标记抗小鼠IgG, FITC标记抗小鼠IgG购自博士德公司. 小量质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自华瞬生物工程公司. PCR试剂盒、各种限制性内切酶购自TaKaRa公司. 根据GenBank中EBNA2基因的序列，设计2条引物：引物2的5′端加入XhoⅠ位点，引物1和引物2用于扩增EBNA2基因的3′端部分（EBNA2b）. 引物1：5′CTCGGGGCCACCATGGTGGC3′；引物2:5′CGCCTCGAGTTACTGGATGGAGGGG3′.
1.2方法
1.2.1EBNA2基因的克隆及真核表达载体的构建EcoRⅠ/BglⅡ/SalⅠ三酶切质粒pSG5EBNA2，胶回收4.0 kb大小片段，将回收片段插入经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切开的pBluscript（-）载体中，命名为pBSSKEBNA2. 以pSG5EBNA2为模板，用引物1和引物2进行常规PCR反应，扩增EBNA2基因的3′部分EBNA2b. PCR反应条件：于94℃变性5 min后，按下列参数循环35次：即94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后于72℃延伸7 min. PCR产物克隆到pMD18T载体中，NcoⅠ/XhoⅠ酶切鉴定阳性克隆，命名为pMDEBNA2b. 用NcoⅠ/XhoⅠ从pMDEBNA2b中切下EBNA2b片段插入用NcoⅠ/XhoⅠ切开的pBSSKEBNA2载体pBSSKEBNA2a中， NcoⅠ单酶切和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，命名为pBSSKEBNA2（a+b）. pCMVEBNA2用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切质粒pBSSKEBNA2（a+b），回收1500 bp片段，将其插入EcoRⅠ/XhoⅠ切开的pCMVHA载体中，酶切鉴定阳性克隆，命名为pCMVEBNA2.
1.2.2EBNA2表达的检测①Western blotCos7细胞于转染前1 d接种于直径60 mm中皿，接种4×105个细胞, 接种16 h后，应用LipofectamineTM 2000 10 μL转染质粒pCMVEBNA2 4 μg. 转染60 h后裂解细胞收集蛋白上清，加入2×加样缓冲液，煮沸5 min. 然后进行120 g/L SDSPAGE电泳，于180 mA稳压状态下转膜3 h. 于室温用20 g/L蛋白干粉封闭1 h后，一抗antiEBNA2（1∶1000）4℃过夜. PBST洗涤3次，每次5 min. 二抗抗鼠IgGHRP （1∶4000）室温作用1 h，同上洗涤后，进行放射性显影. ②免疫荧光Cos7细胞于转染前1 d接种于直径60 mm中皿，于皿底事先加入圆形玻片，转染过程同上，对照组转染质粒pCMVHA. 转染60 h后取出爬有细胞的玻片，PBS洗涤3次，每次5 min；10 g/L BSA 37℃封闭1 h；一抗antiEBNA2 （1∶200）37℃避光湿盒中染色1 h；同上洗涤；二抗抗鼠IgGFITC （1∶500）37℃避光湿盒中染色1 h；同上洗涤后，荧光显微镜观察.
1.2.3共转染报告质粒检测荧光素酶强度细胞准备和转染过程同上，对照组转染：pGA9816 0.2 μg，βgal 0.2 μg，pCMVHA 1.6 μg；检测组转染：pGA9816 0.2 μg，βgal 0.2 μg，pCMVEBNA2 0.2 μg，pCMVHA 1.4 μg. 转染48 h后收细胞. 反复液氮中冻溶裂解，充分震荡混匀，样品与反应底物1∶5比例混合后，照度仪中检测荧光素酶强度.
2结果
2.1EBNA2基因的克隆及真核表达载体的构建以质粒pSG5EBNA2为模板,PCR扩增EBNA2基因的 3′端部分称为EBNA2b(494 bp),回收后插入载体pMD18T中,获得重组质粒pMDEBNA2b,经过测序,结果证实与GenBank中的相对应部分序列完全一致. 应用限制性内切酶将EBNA2基因的5′端部分EBNA2a插入载体pBluescript(-), 获得重组质粒pBSSKEBNA2a,经过拼接最终获得重组质粒pBSSKEBNA2,酶切鉴定,结果完全符合实验设计. 重组质粒pBSSKEBNA2和质粒pCMVHA分别用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后，进行连接转化，获得重组质粒pCMVEBNA2（图1），经酶切鉴定（图2）正确（EcoRⅠ/XhoⅠ 1470；NcoⅠ 928）.
图1重组质粒pCMVEBNA2
图2重组质粒pCMVEBNA2的酶切鉴定
2.2EBNA2的检测质粒pCMVEBNA2应用脂质体转染Cos7细胞，转染60 h后，收取蛋白上清，Western blot检测EBNA2蛋白的表达，可在Mr 85 000处见一条特异性条带（图3），条带大小符合预期. 质粒pCMVEBNA2和pCMVHA应用脂质体转染Cos7细胞爬片，转染60 h后，取出爬片，免疫荧光检测EBNA2蛋白的表达. 在荧光显微镜下放大20倍时,对照组仅有微弱的非特异荧光，转染组则可见较强荧光(图4).
图3Western blot检测EBNA2的表达
图4免疫荧光检测EBNA2的表达×20
2.3EBNA2荧光素酶检测质粒pCMVEBNA2和报告质粒pGA9816用脂质体lipofectamineTM 2000共转染Cos7细胞，转染48 h后，反复冻融裂解，收取蛋白上清，与作用底物1∶5混合后，于照度仪上检测荧光素酶强度，结果可见共转组与对照组结果存在显著性差异，共转染组是对照组的50倍左右.
3讨论
1964年，英国生物学家Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤中分离得到一种γ疱疹病毒［5］，命名为EB病毒，EBNA2是EB病毒所表达的9种功能性蛋白之一. 在EB病毒感染B淋巴细胞过程中，EBNA2作为关键性的转录因子，通过激活细胞和细菌内的多种靶基因，可以使B淋巴细胞形成永生化. RBPJκ在与notch信号途径胞内段（NotchIC）结合后可以激活下游基因，调节体内的多种生理功能，如造血干细胞的分化，神经元的形成，T/B细胞的发育等［6］. 近年来的研究表明，EBNA2是NotchIC 的一种功能性同源蛋白，它的保守区5和保守区6可以结合于RBPJκ的相应区域［7］，起到类似NotchIC的作用，模仿Notch途径激活下游靶基因. 我们成功地从质粒pSG5EBNA2中再克隆得到了EBNA2基因的全长序列，并插入到真核表达载体pCMVHA，在真核细胞中得到表达. 经过对质粒pSG5EBNA2的5′端编码序列测序，我们发现在EBNA2开放读框起始密码子ATG之前存在一个EcoRⅠ位点，所以我们以EBNA2读框中段的NcoⅠ酶切位点为分界点，将EBNA2分为a和b两部分， 5′端编码序列采用酶切获得，3′端编码序列采用PCR获得，然后再将其拼接成完整读框方法最终得到EBNA2基因的完整序列. EBNA2基因插入HA标签的下游，中间间隔EcoR I位点，所以HA和EBNA2基因分别独立表达.在检测EBNA2蛋白表达的实验中，我们可以看到Western blot的结果条带出现在Mr 85×103左右的位置，这与EBNA2蛋白Mr 53×103存在较大出入. 这主要是由于在EBNA2蛋白中含有28%的脯氨酸，使其分子的二级空间结构变大，EBNA2蛋白在凝胶中迁移速度变慢所造成的. 在检测荧光素酶激活强度的实验中，共转染组约是对照组的50倍左右，充分说明EBNA2蛋白具有转录激活活性. 综上所述，我们克隆得到了EBNA2的全长基因，并证实其在真核表达系统中能够表达，为以后将其克隆入其他表达载体，进行进一步的功能研究提供方便，为进一步探讨EBNA2对免疫系统发育的影响奠定了基础.
【】
［1］ Sung NS, Kenney S, Gutsch D, et al. EBNA2 transactivates a lymphoidspecific enhancer in the BamHI C promoter of EpsteinBarr virus［J］. J Virol, 1991,65:2164-2169.
［2］ ArtavanisTsakonas S, Matsuno K, Fortini ME. Notch signalling［J］.Science, 1995,268:225-232.
［3］ Sakai T, Taniguchi Y, Tamura K, et al. Functional replacement of the intracellular region of the notch1 receptor by EpsteinBarr virus nuclear antigen 2［J］. J Virol, 1998, 6034-6039.
［4］ Lin CS, Kuo HH, Wang WB，et al. EpsteinBarr virus nuclearantigen 2 retards cell growth, induces p21WAF1 expression, and modulates p53 activity posttranslationally［J］. J Mol Biol, 2000, 303, 7-23.
［5］ Küppers R. B cells under influence: Transformation of B cellsby epsteinbarr virus［J］．Nat Rev Immunol,2003,10(3):801-812.
［6］ Han H, Tanigaki K, Honjo T, et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding proteinJ reveals its essential role in T versus B lineage decision ［J］. Int Immunol， 2002,14(6):637-645.
［7］ Zhou S F, Fujimuro M, James J, et al. A role for SKIP in EBNA2 activation of CBF1repressed promoters ［J］. J Virol, 2000,74(4): 1939-1947.
