兔颈静脉动脉化后血管的重塑机制
【关键词】 静脉移植；细胞凋亡；模型,动物
Mechanism of vascular remodeling after rabbit jugular vein graft arterialization
【Abstract】 AIM: To establish a rabbit model of carotid arterial venous bridge bypass graft and observe the pathological change of the vein bridge at different phases, to detect the expressions of PCNA and αactin, cell apoptosis, and to investigate the mechanism of vein graft remodeling. METHODS: The common carotid artery and external jugular vein of 30 rabbits were dissociated and anastomosed side by side, so that arterial blood went through external jugular vein bridge. Vein bridges get at different time points after operation were analyzed quantitatively in regard to the thickness of intima and media, and observed in the expressions of PCNA and αactin and cell apoptosis. RESULTS: All rabbits survived. The vein bridge kept smooth. The intima and media proliferated obviously. The wall of vein graft thickened, but the intima proliferated unequally, to the peak in 2 4 weeks. The expression of PCNA occurred in both intima and media, while the expression of αactin occurred only in intima. Cell apoptosis occurred 1 week after operation in intima and media and peaked until 4 weeks. CONCLUSION: Rabbit jugular vein after carotid arterial venous bridge bypass graft showed an unirregular increase in the wall thickness. Proliferation occurred at the early stage mainly in intima. Proliferation of smooth muscle cells in media and their migration into intima , cell apoptosis may all participate in vein graft remodeling.
【Keywords】 venous graft; apoptosis; models, animal
【摘要】 目的： 建立兔颈动脉静脉桥旁路移植模型，观察不同时期静脉桥病理改变及PCNA，αactin表达和检测细胞凋亡，探讨移植静脉重塑机制. 方法： 家兔30只，将一侧颈总动脉与颈外静脉分别游离后，行颈总动脉与颈外静脉侧侧吻合，结扎颈外静脉两吻合口外侧及颈总动脉吻合口中部，使动脉血经颈外静脉桥通过，于术后不同时间段取静脉桥行HE及弹力纤维染色，定量分析血管壁内膜、中膜厚度，观察PCNA，αactin表达和细胞凋亡情况. 结果： 30只家兔全部存活，静脉桥全部保持通畅；病理所见静脉桥血管壁增厚、血管内膜及中膜均明显增生，术后2~4 wk内膜增生达高峰，且厚度不均匀，中膜、内膜均有PCNA阳性表达，内膜出现αactin阳性表达，术后1 wk血管内膜及中膜开始出现凋亡细胞，术后4 wk达高峰. 结论： 兔颈静脉动脉化后静脉血管管壁呈不均一性增厚，早期以血管内膜增生为主，中膜血管平滑肌细胞增殖并向内膜迁移，细胞凋亡可能参与血管桥重塑.
【关键词】 静脉移植；细胞凋亡；模型，动物
0引言
静脉血管作为血管桥材料在冠状动脉旁路移植术中具有重要作用，但血管的再狭窄一直是困扰静脉移植的难题，影响冠状动脉旁路移植术的近远期疗效. 为了研究静脉血管动脉化后的改变，我们建立了兔颈动脉静脉旁路移植模型，对静脉血管移植于动脉后不同时间段的病理改变进行观察，通过血管壁PCNA, αactin表达和细胞凋亡的检测，初步探讨静脉血管重塑的机制.
1材料和方法
1.1材料健康家兔36只由沈阳军区总动物实验外科提供，雌雄不拘，体质量（3±0.5） kg. 10 g/L戊巴比妥钠耳缘iv麻醉（1 mg/kg），仰卧位固定于手术台. 术前iv青霉素30 kU/kg. 随机分为6组，每组6只，其中5组为实验组,1组为对照组. 实验组在麻醉状态下分别于术后3 d, 1, 2, 4, 8 wk取血管桥.
1.2方法麻醉后将家兔仰卧位固定于手术台，颈部脱毛备皮，取颈正中切口，长约5 cm，切开皮肤及皮下结缔组织，首先在胸骨乳突肌内缘，分离胸骨舌骨肌与胸骨甲状肌之间的结缔组织，沿肌缝即找到颈总动脉，钝性游离，顺血管神经束内神经和血管的行走方向分离出颈总动脉，长约2.5 cm，在动脉下面引过2根丝线，轻轻提起显露颈总动脉；然后在颈部皮下胸骨乳突肌外缘寻找到颈外静脉，沿血管走行方向，将颈外静脉周围的结缔组织轻轻分离，上至上颌外静脉与上颌内静脉分叉处，下至胸骨水平，结扎各分支，游离颈外静脉长约2.5 cm，在静脉下面引过2根丝线，轻轻提起，在胸骨乳突肌前与颈总动脉平行并拢. 静脉注射肝素钠（1 mg/kg），全身部分肝素化，将静脉远近两端结扎，动脉远近两端置无创血管夹，将动静脉平行并拢，两端血管对应处分别切长约3 mm纵切口，用8 0 Prolene线连续缝合，行动静脉侧侧吻合，吻合好后排气，恢复血流，然后将动脉两吻合口中部结扎，使动脉血流自静脉桥通过，确定血流通畅，彻底止血后缝合颈部切口. 实验动物麻醉恢复后送动物实验中心饲养. 肌肉注射青霉素（30 kU/kg）预防感染，连续3 d. 于术后3 d, 1, 2, 4, 8 wk取血管桥标本，麻醉后沿原切口显露移植的静脉桥，用40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成5 μm切片，常规脱蜡至水，行HE染色和弹力纤维染色，光镜下观察移植后内膜的动态变化. 日本产LuzexF显微图像分析系统分析血管壁内膜及中膜厚度.
1.2.1免疫组化染色标本经石蜡包埋后切片，片厚5 μm，常规脱蜡至水，以αactin（稀释度1∶200，美国Dako公司），PCNA（稀释度1∶100，美国Dako公司）单克隆抗体常规SABC染色（博士德公司试剂盒），苏木精复染. 每个标本随机选取4个部位，每个高倍镜视野下PCNA阳性细胞及细胞总数，取平均数计算细胞增殖指数. 细胞增殖指数（%）=PCNA阳性细胞数/细胞总数×100.
1.2.2凋亡细胞的检测标本经石蜡包埋后切片，片厚5 μm，常规脱蜡至水，以TUNEL法检测细胞凋亡（博士德公司试剂盒），检测方法严格按试剂盒说明书进行. 每个标本随机选取4个部位，计算每个高倍镜视野下TUNEL阳性细胞及细胞总数，取平均数计算细胞凋亡指数. 细胞凋亡指数（%）=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100.
统计学处理： 数据以x±s表示，组间比较采用非参数秩和检验，P<0.05为有统计学差异.
2结果
2.1移植静脉的组织病变化所有家兔全部成活，无意外死亡，大体标本观察移植静脉桥全部保持通畅，管腔扩张，静脉桥管壁不同程度增厚（图1）. 正常静脉内膜仅覆盖单层内皮细胞,中膜很薄,由2~3层血管平滑肌细胞及少量胶原组成（图2A）. 术后3 d静脉桥管腔扩大，内皮细胞部分脱落，中膜弹性纤维无明显增多，未见明显新生内膜；术后1 wk局部新生内膜形成，不连续，内皮细胞稀少，中膜弹性纤维增多（图2B），术后2 wk内皮细胞覆盖绝大部分内膜，新生内膜进一步增厚，中膜弹性纤维明显增多，术后4 wk内皮细胞完全修复，内膜继续增厚，且呈局灶性，厚薄不均一，内见弹性纤维及胶原沉积，增生内膜中可见大量泡沫细胞（图2C）；术后8 wk内皮细胞排列整齐，内膜厚度减小，厚薄均一，弹性纤维增多增粗，分布于内膜深层，中膜继续增厚（图2D，表1).
图1术后4 kw大体标本见移植静脉管腔扩张，管壁增厚（略）
A: 正常静脉移植；B: 1 wk；C: 4 wk；D: 8 kw.
图2 兔颈静脉动脉化后光镜下血管壁变化HE ×400（略）
2.2免疫组化及细胞凋亡分析术后3 d中膜PCNA及 αactin染色阳性；术后1 wk中膜和新生内膜αactin染色阳性细胞增多，可见少量凋亡细胞；术后2 wk新生内膜 PCNA阳性率最高，αactin染色加深；术后4 wk PCNA阳性细胞减少，凋亡细胞增多并达到高峰；术后8 wk PCNA阳性率降低，细胞凋亡率降低(表2).
表1移植静脉内膜、中膜厚度和I/M比值的动态变化（略）
aP<0.05 vs对照, cP<0.05 vs 1 wk.
表2移植静脉内膜平滑肌细胞增殖指数及凋亡指数的动态变化（略）
aP<0.05 vs对照, cP<0.05 vs 1 wk.
3讨论
静脉作为动脉移植物后发生一系列变化，包括内膜增厚、外膜纤维化、内1/3中膜缺乏、弹力纤维缺失等［1］. 研究静脉血管动脉化后的改变，有多种动物模型尝试，有作者应用犬行冠状动脉旁路移植术［2］，接近临床冠状动脉旁路移植手术模式，但操作复杂，费用高，犬不易成活，而且犬冠状动脉存在大量的侧支循环，不易判断手术效果. 有作者应用兔颈静脉桥与颈动脉做端端吻合［3］，因静脉壁特别薄，切断后吻合困难. 本实验建立的动物模型，行颈部动静脉侧侧吻合，操作简单，费用小，重复性好，血流通过静脉桥时局部有血液湍流存在，符合临床冠状动脉旁路移植术静脉桥内血液流体力学要求，对血管桥内皮损伤小，发生血栓机率小，可行性好，可替代临床进行CABG术后静脉桥近期及远期通畅率干预性研究. 颈外静脉无静脉瓣，无需将静脉倒转，30例实验无血流受阻现象发生.
我们观察不同时间段血管桥病理改变，见术后1 wk静脉桥血管壁增厚，内膜及中膜均明显增厚，中膜弹性纤维增多，术后2~4 wk内膜增厚达高峰，且不均匀，中膜、内膜均有PCNA阳性表达，内膜出现αactin阳性细胞表达，说明中膜平滑肌细胞增生，迁移至内膜，参与新内膜形成，使内膜增厚，此期血管内膜结构疏松，可能是平滑肌细胞表型转变为分泌型，分泌大量细胞外基质［2］. 术后4 wk增生内膜中可见大量泡沫细胞，可能是晚期形成血管粥样硬化的潜在因素. 术后8 wk血管内膜结构致密，中膜弹性纤维明显增多，排列整齐. 术后1 wk中膜和新生内膜可见少量凋亡细胞，术后4 wk凋亡细胞增多并达到高峰，术后8 wk细胞凋亡率降低，细胞凋亡可能参与血管重塑.
【】
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［3］ 朱海龙，杨景学，张卫达, 等. 实验型自体静脉移植内膜增生模型的建立［J］. 第四军医大学学报，2000,21(5):589-591.
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