陕西汉族人p53 codon 72基因多态性与子宫颈鳞癌易患性的关系： 病例对照研究

【关键词】  基因,p53;codon,72;多态现象,遗传；宫颈肿瘤；癌,鳞状细胞

　　Relationship between p53 codon 72 polymorphism and liability of squamous cervical cancer in Han population of Shaanxi province: Casecontrol study

　　【Abstract】　AIM:  To explore the relationship between genetic polymorphism of p53 codon 72 and the risk of squamous cervical cancer.  METHODS:  A casecontrol study was conducted in Han population of Shaanxi province, involving 33 women with squamous cervical carcinoma as experimental group, and 51 same ethical normal women as control group. DNA extracted from peripheral blood samples and pathologic tissues were examined by PCR with allele specific primers.  RESULTS:  The rates of arginine (Arg) and proline (Pro) homozygosity and Arg/Pro heterozygosity were 33%, 15% and 52% in experimental group, respectively, 22%, 18% and 61% in control group, respectively. The A of  Pro/Pro or Arg/Pro genotype was 1.80 (95%CI=0.378.97) compared with Arg/Arg genotype. The A of  Pro allele compared with Arg allele was 1.34 (95%CI=0.682.62) . Chisquare analysis showed no significant differences between the 2 groups (P>0.05). CONCLUSION:　Polymorphism at codon 72 of p53 gene may be  not associated with an increased susceptibility to squamous cervical cancer.

　　【Keywords】 genes, p53;  codon 72;  polymorphism, genetic; cervix neoplasms; carcinoma, squamous cell

　　【摘要】 目的： 探讨p53 72密码基因多态性与子宫颈鳞癌易患性的关系.   方法： 在陕西地区汉族妇女中，对子宫颈鳞癌患者33例，健康对照51例进行病例对照研究，用聚合酶链反应法检测p53 codon 72多态性. 结果： p53 codon 72 Arg纯合子、pro纯合子、Arg/pro杂合子在病例组分别是33%, 15%, 52%；在对照组分别是22%, 18%, 61%. p53 codon 72 Arg/Arg基因型与Pro/Pro和Arg/Pro两种基因型相比A值=1.80, 95%CI=0.37～8.97，差异无统计意义（P>0.05）. 结论： p53 codon 72 Arg纯合子可能不增加陕西地区汉族人子宫颈鳞癌易患性.
 
　　【关键词】　基因，p53;codon 72;多态现象，遗传；宫颈肿瘤；癌，鳞状细胞

　　0引言

　　子宫颈癌是常见的恶性肿瘤，发病率有明显的地区差异. 我国是世界上子宫颈癌高发区之一，每年新增子宫颈癌患者在13.15万人左右，死亡率较高［1］. 流行病学和病毒学研究表明高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染是子宫颈癌的主要致癌因素［2］，但并不是所有人感染高危型HPV后都进一步为子宫颈癌. 1998年Storey等［3］提出p53第4外显子72密码的基因多态性可能是机体易患子宫颈癌的一个重要基因遗传因素，Arg/Arg基因型可增加患子宫颈癌的风险.
 
　　有研究表明p53 codon 72多态性具有明显的种族和地区间差异［4］,因此我们选择我国子宫颈癌高发的陕西省，针对汉族人进行了病例对照研究，旨在探讨陕西地区汉族人p53 codon 72多态性与子宫颈鳞癌易患性的关系.

　　1对象与方法

　　1.1对象收集200306/200406在陕西省肿瘤住院的子宫颈鳞癌病例共33例，对照为在西安市疾病预防控制中心健康查体的同地区汉族女性共51例.
 
　　1.2调查内容采用统一调查表形式，包括基本人口资料、卫生习惯、既往疾病和家族史、临床和病理资料等.
 
　　1.3样本和DNA样品制备手术取未经过放疗和化疗的子宫颈鳞癌患者的宫颈组织，清洁后在0.5 h内冷藏送-70℃冰箱保存，直至DNA提取，另取肿瘤组织送病理检查以明确诊断. 病例组采用杭州维特杰公司的动物组织基因提取试剂盒提取DNA. 健康对照组采集静脉血3 mL存于EDTA作抗凝剂的真空干燥管内，0.5 h内送-70℃冰箱保存，DNA提取采用北京鼎国公司的动物全血DNA提取试剂盒.
 
　　1.4基因型检测p53 Arg和p53 Pro序列分别用等位基因特异性引物核苷酸（表1）进行扩增. PCR反应体系为：  10×1.5 μL buffer,  4×10 μmol/L dNTP 0.4 μL, Mg2+ 1.5 mmol/L, 20 μmol/L正义引物和反义引物0.25 μL， 1 μL Taq DNA聚合酶（均购自美国MBI公司），添加双蒸水至15 μL. 反应条件为： 94℃ 4 min预变性，94℃ 40 s, 61℃ 40 s（Arg序列引物），59℃ 40 s（Pro序列引物）退火，72℃ 40 s延伸，最后72℃延伸10 min. PCR循环35个周期，分别取10 μL在2.5%琼脂糖凝胶中电泳，p53 Arg特异性产物为141 bp，p53 Pro的PCR产物为177 bp（图1）.

　　表1p53 codon 72特异性等位基因引物核苷酸序列（略）

　　M: Marker 100~600 bp; 1,3,5: Pro 177bp PCR产物; 2,4,6: Arg 141bp PCR产物.
 
　　图1p53 codon 72特异性扩增产物电泳结果（略）

　　统计学处理：  所有数据用SPSS10.0软件进行统计分析，子宫颈癌组和正常对照组间的差异比较采用χ2检测，A及95%CI用以进行危险度评价.

　　2结果

　　p53 codon 72 Arg和Pro两个等位基因在病例组中所占比例分别为59%和41%，在对照组中分别为52%和48%，两组等位基因的分布未见显著差异（P>0.05）. 以Pro等位基因做参比对照， Arg等位基因与其比较A=1.34　（95%CI=0.68～2.62）. p53 codon 72 Arg/Arg, Arg/Pro和Pro/Pro 3种基因型在病例组中所占比例分别为33%，52%和15%，在对照组中分别为22%，61%，18%，两组3种基因型分布也未见显著差异（P>0.05）. 以Pro/Pro作为参比对照基因型，Arg/Arg与其比较A=1.80 （95%CI=0.37～8.97），Arg/Pro与其比较A=0.99 （95%CI=0.25～4.08），进一步将Arg/Pro和Pro/Pro 2基因型合并为参比对照，Arg/Arg基因型与其比较A=1.82 （95%CI=0.82～2.41），差异无统计学意义（P>0.05，表2）.

　　表2p53基因型在病例组和对照组中的分布（略）

　　3讨论
 
　　子宫颈鳞癌发病机制到目前为止尚不清楚，许多研究证明是一个复杂的多步骤多因素作用的结果，涉及遗传及外源性的诸多因素.
 
　　1998年Storey等［3］提出p53 codon 72的一个单核苷酸基因多态性能增加子宫颈癌易患性. 表现为此基因座是p53 Pro（脯氨酸，密码为CGC），或者是p53 Arg（精氨酸，密码为CCC），为精氨酸纯合子(Arg/Arg)型的p53蛋白的降解比p53 codon 72为脯氨酸纯合子（Pro/Pro）型的p53蛋白快. 推断其失活更易引起子宫颈瘤发生. 但此后许多相关研究对此存在争论，不同地区种族得出的结论并不相同，目前普遍认为此基因多态性与地区和种族人群差异有关［5-8］.
 
　　我国有关p53 codon 72多态性与子宫颈癌易患性研究，目前检索到的只有郗明蓉等［9］1篇，报道宫颈癌组和正常对照组p53 Arg 纯合子基因型频率相比，有显著性差异(χ2=6.45, P<0.05). 而我们此次针对陕西地区汉族人的研究并未得出阳性结论，考虑有以下几方面因素： ① 样本量的大小和对照人群的选择. 我们的研究样本量是郗明蓉等人研究样本量的2倍多. 穆丽娜等［10］有关p53 codon 72基因多态性与胃癌危险度关系的研究中270名正常女性对照中Arg纯合子占30%，与我们研究对照组中Arg纯合子占约22%. 1998年Story等［3］用30名子宫颈癌病例和41名正常对照得出p53 codon 72基因型为Arg纯合子的患者患HPV相关子宫颈癌的风险是杂合子的7倍，但其后Lanham等［11］对英国白人妇女研究扩大样本量近10倍，结果并不支持此假设，可能是样本量小，抽样误差产生的偏倚. 另外，我们选择以同地区同种族健康人作为对照更具有代表性. ② DNA的来源可能会影响基因的检测. 从石蜡标本提取的DNA片段完整性较差，不利于较长片段的扩增. Arg扩增片段为141 bp, Pro扩增片段为177 bp，比Arg扩增片段长25%，而从新鲜组织或外周血标本中提取的DNA片段较为完整. 病例组Arg纯合子所占比例高于对照组，也可能存在标本来源导致的偏倚. 另外，由于不适宜选择对照宫颈组织提取DNA，所以为了进一步去除标本来源偏倚，我们同时采集病例组外周血做PCR检测，与新鲜组织标本的检测结果一致，因此在此不考虑其对p53 codon 72基因型检测影响.
 
　　除去这些因素的影响，少数几个种族和地域的研究支持Story等［3］的假设，如希腊［12］、南非［13］等，这些研究中对照人群的Arg/Arg基因型所占比例较低（9%～20%）,而对照人群中的Arg/Arg基因型所占比例较高（47%～56%）的美国白人［14］等相关研究并未得出此结论. 我国有关p53 codon 72多态性与肿瘤关系的研究中，除郗明蓉等［9］的对照人群Arg/Arg基因型比例为40%以外，其余的均偏小（<30%），并未证明汉族人群此基因多态性与子宫颈鳞癌有关，考虑此基因多态性与子宫颈癌的关系除受到对照人群的Arg/Arg基因型比例影响外，可能还有其它因素影响. Duin 等［15］研究认为在p53 Arg/Arg妇女中，感染HPV16 350T（HPV16 E6开放读码框内350位核苷酸碱基由T替换G）变体有较高的患子宫颈癌风险，因此有必要进一步对此基因多态性与子宫颈癌关系及其他影响因素进行研究.

　　【文献】

　　［1］ 杨玲，皇甫小梅，张思维，等. 20世纪70年代与90年代子宫颈癌死亡率及其变化趋势［J］. 中国医学院学报，2003,25(4):386-390.

　　［2］ Munoz N. Human papillomavirus and cancer: The epidemiological evidence ［J］. J Clin Virol, 2000,19:1-5.

　　［3］ Storey A, Thomas M, Kalita A, et al. Role of p53 polymorphism in the development of human papillomavirusassociated cancer ［J］. Nature, 1998,393:229-234.

　　［4］ Beckman G, Birgander R, Sjalander  A, et al. Is p53 polymorphism maintained by natural selection  ［J］?  Hum Hered, 1994,44:266-270.

　　［5］ Zehbe I, Voglino G, Wilander E, et al. Codon 72 polymorphism of p53 and its association with cervical cancer ［J］. Lancet, 1999,354:218-219.

　　［6］Makni H, Franco EL, Kaiano J, et al. P53 polymorphism in codon 72 and risk of human papillomavirusinduced cervical cancer: Effect of interlaboratory variation ［J］. Int J Cancer, 2000,87:528-533.

　　［7］ Abba MC, Villaverde LM, Gomez MA, et al. The p53 codon 72 genotypes in HPV infection and cervical disease ［J］. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2003,109:63-66.

　　［8］  Humbey O, Aubin F, CaireyRemonnay S, et al. TP53 polymorphism at exon 4 in Caucasian women from eastern France: Lack of correlation with HPV status and grade of cervical precancerous lesions ［J］. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2002,103:60-64.

　　［9］ 郄明蓉，张燕华，吴俊梅，等. P53 codon 72多态性与宫颈癌关系的研究［J］. 华西医大学报,2002,33:274-275.

　　［10］ 穆丽娜，周学富，丁保国，等. P53 codon 72基因多态性与胃癌危险度关系病例对照研究［J］. 中国癌症杂志,2003,13(1):1-4.

　　［11］ Lanham S, Campbell I, Watt P, et al. p53 polymorphism and risk of cervical cancer ［J］. Lancet, 1998,352:1631.

　　［12］ Dokianakis DN, Spandidos DA.  P53 codon 72 polymorphism as a risk factor in the development of HPVassociated cervical cancer ［J］. Mol Cell Biol Res Commun, 2000,3:111-114.

　　［13］  Pegoraro RJ, Rom I, Lanning PA, et al. P53 codon 72 polymorphism and human papillomavirus type in relation to cervical cancer in South African women ［J］. Int J Gynecol Cancer, 2002,12(4):383-388.

　　［14］ Calhoun ES, McGovern RM, Janney CA, et al. Host genetic polymorphism analysis in cervical cancer ［J］. Clin Chem, 2002,48(8):1218-1224.

　　［15］ Duin  MV, Snijders PJ, Vossen MT,et al. Analysis of human papillomavirus type 16 E6 variants in relation to p53 codon 72 polymorphism genotypes in cervical carcinogenesis ［J］. J Gen Virol, 2000,81:317-325.