不同浓度尿酸和胰岛素对猪近端肾小管上皮细胞株cAMP水平及Na+

        作者：孙珲，李晓苗，宋白利，刘新平，药立波，姬秋和

【关键词】  尿酸；胰岛素；肾小管,近端/细胞学；环AMP；Na+

    【Abstract】 AIM: To observe the effect of metabolic correlation factors on ionic transport and cell apoptosis of  proximal renal tubular epithelial cells at the cellular level through observing the effects of uric acid and insulin of different concentrations on cAMP and Na+K+ATPase in proximal renal tubular epithelial cell line LLCPK1. METHODS: Proximal renal tubular epithelial cells (LLCPK1) from pig were cultured for 24 h in the medium supplemented with uric acid at 0, 0.1, 0.2, 0.4 mmol/L and insulin at 0, 10-9, 10-8, 10-7 mol/L; and then were  observed in the level of cAMP into LLCPK1 cells, the activity of Na+K+ATPase and the results of ionic transport. RESULTS: After LLCPK1 cells were exposed to different concentrations of uric acid and insulin for 24 h，in uric acid group the activity of cAMP,［Ca2+］,［Na+］were significantly increased in a concentrationdependent manner, but Na+K+ATPase activity, ［K+］ dropped in highconcentration insulin groups, ［Ca2+］ and ［Na+］ were significantly elevated,but cAMP, Na+K+ATPase and ［K+］were decreased. CONCLUSION: Uric acid and insulin could cause the increase of the concentration of calcium ion in cell, which might lead to cell dropsy and even induce apoptosis. In addition, high concentration of uric acid and insulin could do damages to LLCPK1 coordinately.

    【Keywords】 uric acid;  insulin; kidney tubules, proximal/cytology;  cyclic AMP; Na+K+exchanging ATPase

    【摘要】 目的： 观察不同浓度尿酸和胰岛素对猪近端肾小管上皮细胞株（LLCPK1）细胞内环腺苷酸（cAMP）水平和Na+K+ATP酶活性的改变，探讨代谢相关因素在细胞水平对近端肾小管上皮细胞的离子转运和细胞凋亡影响. 方法： 以LLCPK1为研究对象，观察尿酸浓度为0, 0.1, 0.2和0.4 mmol/L和胰岛素浓度为0, 10-9, 10-8, 10-7 mol/L培养24 h条件下，LLCPK1细胞内cAMP水平、Na+K+ATP酶活性的改变以及离子转运情况. 结果： 0.1, 0.2和0.4 mmol/L尿酸刺激24 h, LLCPK1的cAMP水平、细胞Ca2+, Na+浓度升高，而Na+K+ATP酶的活性、K+浓度下降；胰岛素在高浓度时引起细胞内游离Ca2+, Na+浓度增高，而cAMP水平，Na+K+ATP酶活性及K+浓度下降. 结论： 尿酸和胰岛素均对LLCPK1细胞具有明显的影响，可能与代谢综合征时肾脏功能改变的发生或保护机制有关.

    【关键词】 尿酸；胰岛素；肾小管，近端/细胞学；环AMP；Na+K+交换ATP酶

       环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）作为激素的第二信使理论后，引起人们的关注,cAMP通过调节酶的活性，对细胞的代谢起着重要的调节作用. 而Na+K+ATP酶是位于细胞膜上的一种糖蛋白，与ATP的分解和细胞内外Na+,K+离子的转运密切相关;它也是一种十分重要的生物酶，在物质的传送、能量的转换以及信息传递方面具有重要作用［1］. 近年来有关细胞cAMP水平和Na+K+ATP酶活性的研究报道较多，而对肾脏研究的报道较少. 我们观察了不同浓度尿酸和胰岛素对猪近端肾小管上皮细胞cAMP水平和Na+K+ATP酶活性的改变，探讨代谢相关因素在细胞水平对近端肾小管上皮细胞的离子转运和细胞凋亡的影响.

    1材料和方法

    1.1材料猪的近端肾小管上皮细胞株（LLCPK1，北京解放军总肾脏内科付博博士馈赠）；低糖DMEM（美国GIBCO公司产品）；100 mL/L胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶EDTA（美国GIBCO公司产品）；2， 5二苯基恶唑(PPO)，1， 4 双二(5苯基恶唑基)苯(POPOP)(上海化学试剂二厂产品)；MgSO4, KCl, EDTA, NaCl，三氯醋酸，TrisHCL缓冲液(pH 7.4)； NA+K+ATP酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；cAMP测定试剂盒（原子能研究院产品）.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养和处理猪近端肾小管上皮细胞株(LLCPK1)用含100 mL/L胎牛血清的DMED放置CO2孵育箱37℃培养, 3 d后观察换液，4～8 d有上皮细胞长出，以后每周换液2次. 细胞长满后用20 mL/L胰蛋白酶EDTA消化细胞传代培养,选取3～7代细胞用于实验. 培养24 h后，接种于96孔平底细胞板，每孔细胞数5×105，随机分为两组，分别加入不同浓度尿酸（0, 0.1,  0.2, 0.4 mmol/L）和胰岛素（0, 10-9, 10-8,10-7 mol/L），分别刺激细胞24 h,每个浓度设置5个复孔,观察以上两种物质不同浓度时的cAMP水平，Na+K+ATP酶活性及细胞内Ca2+, Na+, K+浓度的变化.

    1.2.2cAMP测定按cAMP测定药盒说明进行. 采用竞争性蛋白结合分析法测定cAMP含量，整个反应都在冰浴下进行. 反应结束后，于测量杯中加入闪烁液PPO和POPOP，盖严、摇匀，在液体闪烁仪上测定放射性活度. 测得的结果按要求作标准曲线并求算样品cAMP含量.

    1.2.3细胞膜Na+K+ATP酶测定将培养细胞消化，离心，弃上清，留下层细胞，用生理盐水或浆介质制备成107/μL的悬液，再进行破碎. 制备好的细胞悬液不要离心，在测试加样前要摇匀后取样；严格按照说明配制酶促反应试剂盒定磷剂，试剂配制使用双蒸水，离心管，试管均使用一次性塑料制品，所有玻璃器皿均先洗涤并经稀酸浸泡，再经流水和双蒸水洗涤，确保去除所有残留无机磷；按试剂盒说明顺序及比例在玻璃心管中加入试剂和标本，轻轻混匀，置入控温水浴箱，37℃水浴准确反应10 min. 静置至室温. 4000 r/min 10 min，取上清200 μL定磷；在一次性试管中加入标准磷应用液，上清液和定磷剂，混匀，水浴30  min，冷却在595 nm波长处比色，读取A值即可算出含量.细胞内游离钙.

    1.2.4细胞内游离钙测定用离心方法浓集细胞，使细胞悬液浓度控制在2~4×1010/L，加入Fura2/Am，使其终浓度达5 μmol，使Fura2/Am进入细胞并充分反应.  将细胞悬液置于50 mL/L CO2培养箱中，在37℃恒温下孵育50 min. 负载后的细胞用Hepes缓冲的Hanks液洗3次. 用2.5 mL Hepes缓冲的Hanks 液悬浮细胞备用. 采用RF5000型荧光分光光度计，其激发光栅为5 nm，发射光栅为10 nm. 首先扫描测定Fura2/Am标准液、负载液及Fura2/Am与细胞悬液温育后的细胞悬液的荧光光谱. 用机按下式计算: Ca2+＝k（d）×［（FFmin）/（FmaxF）］. 其中，k（d）为Fura2与Ca2+反应的解离常数(224 nmol/L)；Fmin为无Ca2+时细胞内荧光强度，Fmax为Ca2+饱和时细胞内的荧光强度. 实验时，先测定静息状态下和加入各种影响因素后的F值，然后加入浓度为1 　mL/L Triton X100 测定Fmax，加入终浓度为3 mmol/L EGTA测定Fmin.

    1.2.5胞内Na+，K+含量测定采用VIDO22原子发射/原子吸收分光光度计测定.

    统计学处理： 数据用x±s表示，用SPSS11.5软件进行分析，各物质不同浓度间比较用方差分析，两两比较用Dunnettt检验. P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1不同浓度尿酸对LLCPK1的影响不同浓度尿酸作用24 h后细胞cAMP水平、细胞Ca2+, Na+浓度随着尿酸的浓度的增加而增加，与0 mmol/L比较差异有统计学意义（P<0.05）；而Na+K+ATP酶活性和K+浓度随着尿酸的浓度的增加而降低，与0 mmol/L比较差异有统计学意义（P<0.05，表1）.

    2.2不同浓度胰岛素对LLCPK1的影响结果显示细胞Ca2+, Na+浓度随着胰岛素的浓度的增加而增加，与0 mol/L比较差异有统计学意义（P<0.05）；而cAMP水平、Na+K+ATP酶活性和K+浓度随着胰岛素的浓度的增加而降低，与0 mol/L比较差异有统计学意义(P<0.05，表1）.

    3讨论

    尿酸和胰岛素均对LLCPK1细胞具有明显的影响，这可能与代谢综合征时肾脏功能改变的发生或保护机制有关. 为了探讨代谢相关因素特别是尿酸和胰岛素在细胞水平对近端肾小管上皮细胞的离子转运机制和细胞凋亡的影响，我们观察了不同浓度尿酸和胰岛素对LLCPK1细胞株cAMP水平和Na+K+ATP酶活性的影响. 目前尚无尿酸对LLCPK1细胞内cAMP水平和Na+K+ATP酶活性的影响的报道. 生理浓度的尿酸已被证实具有“抗氧化效应”［2-3］，并且在体内可阻抑氧化应激［4］，但亦有研究发现，高浓度的尿酸对肾脏有着直接的致病作用［5-6］. 本结果显示，生理浓度尿酸即可引起cAMP水平、细胞Ca2+, Na+浓度升高，而Na+K+ATP酶的活性、K+浓度下降，这些改变的作用尚不明确，但提示此浓度的尿酸对LLCPK1细胞的离子平衡和信号系统具有一定的影响.表1不同浓度尿酸和胰岛素刺激LLCPK1细胞24 h后cAMP, Na+K+ATP酶及细胞Ca2+, Na+, K+浓度变化（n=5, x±s）

    cAMP作为重要的细胞内信使物质，被认为是胰岛素的第二信使，且cAMP与胰岛素受体数量有关. 我们观察到浓度从10-9 mol/L到10-7 mol/L的胰岛素刺激24 h后，LLCPK1细胞的Ca2+和Na+浓度随着浓度的增加而增加；而cAMP水平、Na+K+ATP酶活性和K+则随着胰岛素浓度的增加而降低. 目前尚无胰岛素对LLCPK1细胞内cAMP水平和Na+K+ATP酶活性影响的报道，但亦有研究表明胰岛素可以使胰岛素细胞内cAMP水平减少［7］， Na+K+ATP酶活性降低［8］. 这一现象与我们所观察的不同浓度胰岛素对LLCPK1细胞的cAMP水平和Na+K+ATP酶活性影响的结果一致.

    我们研究发现，Ca2+与cAMP的作用密切相关，二者协调发挥作用，并认识到Ca2+的第二信使作用是当细胞外信息作用到细胞表面特异受体后，引起细胞膜Ca2+通道开启，进一步通过磷脂酰肌醇信使系统使细胞内Ca2+贮池中Ca2+动员、在一个短暂的时间内使细胞内Ca2+浓度迅速升高到―个高水平，进而由Ca2+启动许多生理生化过程. 而K+是细胞内维持膜电位的主要阳离子，细胞内的Na+被泵出必然引起细胞外K+的内流，从而维持细胞内Na+, K+代谢平衡及膜电位的稳定性. 当Na+泵出减少，K+内流也减少. 细胞内Na+的积聚，既促进了外向的Na+K+协同转运，使K+外流增加，又导致了细胞内Ca2+的增加. 细胞内高Ca2+状态激活K+通道开放，使Ca2+诱导的K+外流增加. 细胞内Na+的增高和K+的降低破坏了细胞内Na+, K+的平衡关系. 研究中随着胰岛素浓度增加，细胞Ca2+, Na+,  K+, cAMP和Na+K+ATP酶活性均有改变，提示胰岛素对肾小管上皮细胞的膜电位平衡、第二信使系统均有影响，至于哪个环节为始动因素，有待深入研究.

    【】

    ［1］ 姚磊，盛鹏，朱德钟. 肾综合征出血热病毒对体外人血管内皮细胞形态和ATP酶活性的影响［J］. 人兽共患病杂志，2001,17（4）:21.

    ［2］ Fkresti R, Sarathchandra P, Clark JE, et al. Peroxynitrite induces haem oxygenase1 in vascular endothelial cells: A link to apoptksis［J］. Biochem J, 1999,7:29-36.

    ［3］ Kean RB, Spitsin SV, Mikheeva T, et al. The peroxynitrite scavenger uric acid prevents ynflammarory cell invasion into the central nervous system in experimental allergic encephalomyelitis through maintenance of bloodcentral nervous system barrier interity［J］. J Immunol, 2000,165:6511-6518.

    ［4］ Hayden MR, Tyagi SC. Uric acid:A new look at an old risk marker for cardiovascular disease, metabolic syndrome, and type 2 diabetes mellitus: the urate redox shuttle［J］. Nutr Metab (Lond), 2004,1:10.

    ［5］ Johnson  RJ, Kang  DH, Feig D, et al. Is there a pathogenetic  role for nric  acid in hypertension and cardiovascular and renal disease［J］?  Hypertension, 2003,41:1183-1190.

    ［6］ Kang DH, Nakagawa T, Feng L, et al. A role for nric acid in the progression of renal disease［J］. J Am Soc Nephrol, 2002,13:2888-2897.

    ［7］ 冯凯，王，孙琦. 胰岛素、环磷酸腺苷和皮质激素对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子的顺反式调节［J］. 中国医学院学报, 2004,6:639-642.

    ［8］ Owada S, Larsson O, Arkhammar P, et al.  Glucose decreases Na+, K+ATPase activity in pancreatic βcells［J］. J Biol Chem, 1999,274(4):2000-2008.