先天性心脏病合并肺动脉高压一氧化氮合酶mRNA表达及临床意义

【关键词】  心脏缺损,先天性；高血压,肺性；一氧化氮合酶；RNA,信使

    【Abstract】 AIM:  To explore  the  pathophysiological  significance of  nitric oxide(NO) and nitric oxide synthase(NOS) in congenital heart defects with pulmonary hypertension. METHODS:  Twentyfour patients with congenital heart defects  were  divided  into  3 groups:  mild pulmonary hypertension group(n=8), moderate or severe pulmonary hypertension group(n=9), and nonpulmonary hypertension group(n=7). NOS mRNA expression was detected in  lung  tissues  with  reverse  transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR). RESULTS: The NOS mRNA expression levels in the  patients  with  moderate  or severe pulmonary hypertension were much lower than those  in  the ones with mildpulmonary hypertension  or nonpulmonary hypertension (P<0.05). There was an inverse correlation between  the  NOS mRNA  expression level and the pulmonary  arteriopathy  in  the  patients  with  pulmonary hypertension (r=-0.833, P<0.01). CONCLUSION:  In patients with  congenital  heart defects associated with pulmonary hypertension, NO  and  NOS   play  a  role  in pathological process of pulmonary  arteriopathy,  and the NOS mRNA expression level was  proportional to the severity of pulmonary hypertension or pulmonary  arteriopathy.

    【Keywords】  heart defects, congenital;    hypertension, pulmonary;  nitric oxide synthase; RNA, messenger

    【摘要】 目的： 了解一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）在先天性心脏病合并肺动脉高压中的病理生理作用. 方法： 将24例左向右分流先天性心脏病患者分为三组：轻度肺动脉高压8例，中重度肺动脉高压9例和无肺动脉高压7例,应用逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）检测患者肺组织中NOS mRNA的表达. 结果:  NOS mRNA表达水平在中重度肺高压组较轻度肺高压组和无肺高压组显著减低（P<0.05）；NOS mRNA表达与肺高压肺血管病变程度呈负相关（r=-0.833, P<0.01）. 结论: NOS, NO 参与先天性心脏病合并肺动脉高压肺血管病变的病理过程;肺组织NOS mRNA的表达， 随肺动脉高压和肺血管病变程度的加重而下降.

    【关键词】  心脏缺损，先天性；高血压，肺性；一氧化氮合酶；RNA，信使

      左向右分流先天性心脏病，常合并肺动脉高压，其病理特征为渐进性肺血管病变，病变严重程度影响患者的预后， 然而这些肺血管病变发生的机制尚未完全明了. 研究表明，先天性心脏病引起的肺动脉高压,于病变早期即有肺血管内皮细胞超微结构的改变，而血管内皮细胞在合成、释放多种生物活性物质以调节血管张力，抑制平滑肌细胞增生，维持肺循环的低张、低压状态［1］，在延缓肺血管病变的进展方面有重要意义. 其中， 具有多种生理功能的细胞内信息分子一氧化氮（nitric oxide，NO）尤为重要［2］.  NO极不稳定,随着一氧化氮合成的限速酶一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）基因的克隆成功［2］.  为从分子生物学水平研究NO的病理生理作用提供了重要手段. 为此，我们采用分子生物学技术，观察先天性心脏病合并肺动脉高压患者肺组织标本中NOS mRNA 表达情况及其与肺动脉高压严重程度的关系，为阐明NO在先天性心脏病肺动脉高压病理生理中的作用提供理论依据.

    1对象和方法

    1.1对象胸心外科住院病例24(男14,女10). 年龄2~17岁. 经病史、体查、一般化验、胸部正侧位X线片、心电图、彩超等检查. 全部为先天性心脏病，17例并肺动脉高压,其中室间隔缺损19例，室间隔缺损＋主动脉窦瘤破裂1例，室间隔缺损＋房间隔缺损1例，室间隔缺损＋动脉导管未闭1例，房间隔缺损2例. 全部患者都在体外循环下进行手术. 术中在体外循环建立前测量肺动脉压力(PAP)，根据测压将24例病例分为无肺高压组、轻度肺高压组、中重度肺高压组三组，其中７例平均肺动脉压(MPAP)为(17.3±2.4) mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)确定为无肺高压组. 17例平均肺动脉压均超过， 超过国内目前使用的肺动脉高压的诊断标准值（肺动脉平均压大于20 mmHg），并结合临床资料有肺动脉高压表现（如临床听诊P2亢进， 胸片示肺动脉段突出，心电图示双室或右室肥大），认定术前合并肺动脉高压；其中，9例术中测压MPAP为(53.2±9.7) mmHg，肺动脉收缩压(SPAP)与体循环动脉收缩压(SAP)之比为0.76±0.10，确定为中重度肺动脉高压组［4］；8例术中测压MPAP为(24.4±3.3) mmHg, SPAP/SAP为0.36±0.15，确定为轻度肺动脉高压组［4］. 所有受试者均无糖尿病、心肌梗死、肾功能不全和原发性肺动脉高压等病史，未曾使用硝脂类等特殊药物. 三组间年龄、性别、血红蛋白(Hb)、血氧饱和度(SaO2)，均无显著性差别.

    Taq DNA聚合酶和dNTPs购自美国生命技术公司，AMV Reverse Transcription Kit,Pgem7ZF(+)/HaeIII购自Promega公司. NOSmRNA, β2MG mRNA引物由院上海细胞生物研究所合成. NOS mRNA的引物序列［3］（5′引物：GGTGAATCCATACCAGCCTGATCCATGGAACAC, 3′引物：TACTCGAAACGCCTGTCCTTCTTCTTCGAATGG）.     β2MG mRNA引物序列(5′引物：CTCCAAAGATTCAGGTTTAC，   3′引物：ATCTTCAAACCTCCATGATG).

    1.2方法

    1.2.1组织标本的获取和保存于右肺上叶取一肺组织块约3 cm×2 cm×1 cm大小. 采取的组织块放入经处理后的冻存管内(分装)，立即置液氮中速冻，然后置于-70℃保存，以备提取组织总RNA和冰冻切片用.

    1.2.2肺组织血管的病分级肺组织切片，固定，HE染色，然后进行显微镜观察.

    1.2.3NOS mRNA的RTPCR半定量检测用Trizol试剂盒抽提RNA，A值在1.8~2.0之间, 1 μg RNA经反转录后取1/8体积5 μL反应液进行PCR, 条件为94℃  1 min，55℃引物退火2 min，72℃延伸3 min，共进行35个周期. 首次循环前先在94℃变性2 min，最后一次循环后在72℃延伸10 min. NOS和β2MG 在同一管内扩增，取10 μL PCR产物在2 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳、照相. 以图像分析系统对电泳结果照片上NOS,β2MG特异性扩增产物的电泳带密度扫描定量，然后出NOS和β2MG密度之比值，确定NOS mRNA的相对表达水平.

    统计学处理： 用SPSS6.0统计软件包作统计处理，实验数据用x±s表示. 先进行三组间方差齐性检验，在方差齐的基础上作方差分析，若有显著差异，则进一步做三组间两两比较的q检验；对NOS mRNA表达与病理分级进行相关分析,如方差不齐采用秩和检验,P<0.05为有统计学差异.

    2结果

    2.1肺组织血管的病理学分级17例肺高压患者肺组织血管病理改变程度参照 Healthy等［3］的病理分级标准，其中血管形态正常5例，1级改变6例，2级改变4例，3级改变2例. 组织学变化在肌型动脉和细动脉较弹力型动脉明显. 中重度肺高压病例的肺血管改变也明显比轻度肺高压病例的改变重.