背根节初级感觉神经元的温度敏感性

               作者：张磊，王玉英，董辉，胡三觉 

【关键词】  温度敏感性；膜片钳术；神经节,脊；神经元

    【Abstract】 AIM:  To study the effects of temperature on mediumdiameter primary sensory neurons in rat dorsal root ganglion (DRG). METHODS: Wholecell patchclamp recording was performed on mediumdiameter DRG neurons freshly isolated from rats for observing the firing characteristics by temperature gradient stimulation. RESULTS: According to the firing characteristics of the primary sensory medium neurons to the temperature changes in rat DRG, there were 2 classes of cells: In class   Ⅰ,  the medium neuron was temperaturesensitive neuron. Allornone action potentials could be generated and the number of spikes and the frequency decreased with increase of the temperature, and vice versa. The coldsensitive neuron was voltage dependent. In class Ⅱ, the medium neuron was temperatureinsensitive neuron. It only had single action potential with increase or decrease of the temperature, and the amplitude of the single action potential decreased with increase of the temperature. CONCLUSION: The two classes of rat DRG medium neurons have different thermosensitivity.

    【Keywords】 thermosensitivity; patchclamp techniques; ganglia, spinal; neurons

    【摘要】 目的： 观察大鼠背根节 (DRG) 中型神经元的温度敏感性. 方法： 在新鲜分散的大鼠背根节中型神经元运用全细胞膜片钳技术，观察给予不同温度梯度刺激下引起细胞放电的特征. 结果： 根据大鼠背根节中型神经元在不同温度梯度刺激下的放电特征可将它们区分为两类温度敏感神经元. Ⅰ类神经元的温度敏感性与冷温度变化密切相关，随着温度的升高而引发的逐渐增强的膜电位超级化可引发频率由高到低的动作电位. 随着温度的降低神经元又表现出频率由低到高的动作电位变化. 动作电位的幅值一致，符合“全或无”定律. 该类神经元具有电压依赖性. Ⅱ类神经元的兴奋性与温度变化的关系不明显，随着温度升高或降低，神经元只出现一个动作电位，其频率没有变化，仅仅表现在随温度升高，动作电位的幅值降低，温度降低后，其幅值又恢复. 结论： 大鼠DRG两类神经元在温度变化一致的情况下各具不同的冷温度敏感性.

    【关键词】 温度敏感性；膜片钳术；神经节,脊；神经元

     0引言

    为了生存和适应界各种变化, 温度感受是动物最基本的生物行为. 动物通过特殊的温度感受器来感知冷和热. 依据细胞所具有不同的冷热温度感受器，可简单将其温度敏感性分为三类. 这种分类在神经系统具有一定的普遍性［1-2］. 背根节 (dorsal root ganglion, DRG) 是外周感受信号传向中枢所经的第一站，节内细胞复杂多样，其中中、小型细胞传递的信息和冷热觉的关系密切. 目前关于背根节小细胞和冷温度敏感性关系的研究报道较多［3-5］，但有关中型细胞和温度感受及传递关系的研究较少. 本研究采用全细胞膜片钳方法初步探讨背根节上中型神经元的温度敏感性，旨在深入了解初级感觉神经元在温度感受与传递中的作用机制.

    1材料和方法

    1.1材料SD大鼠体质量50~60 g，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供； 胰蛋白酶 (Ⅰ型)，胶原酶 (Ⅲ型)，MgATP均购自美国Sigma公司；Axon200A放大器，美国Axon公司；半导体温度计 (7151型)，上海医用仪表厂.

    1.2方法急性分离DRG细胞后，进行全细胞膜片钳记录. 实验在40个DRG细胞上进行记录，静息膜电位为：(-52.0±3.2)  mV．

    1.2.1DRG细胞的制备SD大鼠在戊巴比妥钠 (40 mg/kg, ip) 麻醉下，迅速取出胸腰段DRG，置于氧饱和的RPMI 1640液中，仔细剪除多余的神经纤维后将神经节置于含酶的RPMI 1640液中 (胰蛋白酶及胶原酶均为0.5 g/L)，37℃消化40  min，加入胰酶抑制剂终止消化．将急性分散的中型DRG细胞置于培养皿中，用细胞外液灌流(1.5 mL/min)，细胞贴壁l h后进行电生理记录．因为DRG细胞形态各异，细胞直径测量方法是先测量细胞的长径和短径，然后相加得到平均直径数值. 依据细胞直径，DRG细胞可分为大型 (d>40 μm),中型 (d =30-40 μm),小型 (d<30 μm) 分别对应于Aα， Aβ， Aδ及C纤维细胞［6］．

    1.2.2电压钳记录采用全细胞膜片钳实验记录．细胞电位钳制在-70 mV，电极电阻约为：4～7 MΩ，封接电阻达到1 GΩ以上．电极内液配方 (mmol/L)： 140 K gluconate, 2 MgCl2, 1.1 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 用KOH将pH调为7.2左右. 细胞外液配方 (mmol/L)： 150 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 3 CaCl2, 10 Glucose, 10 HEPES. 用NaOH将pH调为7.4左右.

    1.2.3电流钳制电压钳模式下启动，先用电压钳模式完成封接，后转向电流钳模式进行记录. 封接电阻低于1 GΩ的细胞放弃，静息电位低于-40 mV，记录中电位衰减明显的细胞放弃.

    1.2.4温度刺激模式灌流液的温度保持在20℃，使用温度控制系统给予不同温度刺激，由半导体温度计即时检测温度变化. 温度变化模式为梯度型变化，分别在20℃, 28℃, 36℃三个温度测量点上记录细胞的放电模式，8℃/min，在每个温度测量点上进行30 s的记录，然后继续升温，升温速度为8℃/min. 根据大鼠DRG中型神经元在不同温度梯度刺激下的放电特征及动作电位数目的变化可将它们区分为两类温度敏感神经元.

    2结果

    根据大鼠DRG中型神经元在不同温度梯度刺激下的放电特征及动作电位数目的变化可将它们区分为两类温度敏感神经元. 给予500 ms的相同去极化方波电流刺激 (1000 pA)，在三个依次升高的温度测量点上记录. 发现12/40的细胞属于Ⅰ类，随温度逐渐升高，该类细胞产生的动作电位数目明显减少，放电频率依次明显降低，细胞的静息膜电位进行性超极化，给予斜波刺激，可见相同的放电变化 (图 1). 另外，在同一细胞上，给予逐渐温度升高的刺激后，改变温度从36℃到20℃变化，细胞表现出相反的放电变化，证明Ⅰ类细胞具有冷温度敏感性. 实验发现另外28个细胞属于Ⅱ类，即温度不敏感性.该类细胞对温度刺激的表现是放电个数及频率稳定，没有变化，仅仅单个放电的幅值发生随温度升高而逐渐降低的变化. 给予斜波刺激，该类细胞没有反应 (图 2).  观察Ⅰ类神经元在20℃测定点上的放电特征，其放电数目较多，在800 pA去极化电流刺激下，动作电位呈很多的短促状放电，放电后有振荡，随着刺激强度的增加 (1000 pA)，放电数目明显增加，放电频率稳定，具有电压依赖性 (图 3). 而在20℃的温度测量点上，给予Ⅱ类细胞800 pA的去极化电流刺激，只产生一个动作电位，刺激强度的增加 (1000 pA)，放电数目和频率不发生变化，仅动作电位的幅值升高 (图 3).

    3讨论

    由于DRG中型细胞和温度感受和传递之间的密切关系，其对温度刺激的反应具有不同的放电特征. 我们以给予不同温度变化刺激引起细胞放电的特征为依据, 将DRG中型细胞分为两类温度敏感性神经元. 其中Ⅱ类神经元在温度刺激下的放电特征和以往报道的温度不敏感性神经元类似［1-2］. 本研究中记录到的Ⅰ类冷温度敏感性神经元，一是电压依赖性的，在同一温度测量点上，给予方波和斜波刺激，该细胞的放电数目及频率均增加. 二是在三个依次升高的温度测量点上，细胞产生的动作电位数目明显减少，放电频率依次明显降低，给予斜波刺激，可见相同的放电变化，证明该类细胞具有明显的温度敏感性［6］. 而在同一细胞上，给予逐渐温度升高的刺激后，反方向降温，细胞即明显表现出与温度变化呈反相关的变化，这些特征与有关报道表现相似［7-8］，但其放电模式及变化还少见报道.

    我们观察到的DRG中型神经元的不同温度敏感性特别是Ⅰ类神经元冷温度敏感性和放电特征，为研究分析不同温度敏感性神经元在温度信息传递整合中的作用提供依据. 因为DRG中各种神经元传导复杂的感觉信息，其中中型神经元与冷热温度的关系非常密切. 在冷热温度信息的感受、传递和整合中，各种神经元的功能和机制不同，按上述分类后，可以从不同的角度研究温度觉形成和传递过程中DRG细胞的不同作用机制.

    【文献】

    ［1］ Li HQ, Liu BG, Dobretsov M, et al. Thermosensitivity of large primary sensory neurons ［J］. Brain Res, 2002,926(1):18-26.

    ［2］ Craig AD, Chen K, Bandy D, et al. Thermosensory activation of insular cortex ［J］. Nat Neurosci, 2000,3(2):184-190.

    ［3］ Viana F, Elvira de P,  Belmonte C. Specificity of cold thermotransduction is determined by differential ionic channel expression ［J］. Nat Neurosci, 2002,5(3):254-260.

    ［4］  Reid G,  Flonta ML. Cold current in thermoreceptive neurons ［J］. Nature, 2001, 313(6): 480.

    ［5］ Cabanes C, Viana F, Belmonte C. Differential thermosensitivity of sensory neurons in the guinea pig trigeminal ganglion ［J］. J Neurophysiol, 2003,90(5):2219-2231.

    ［6］ Scroggs RS, Fox AP. Calcium current variation between acutely isolated adult ratdorsal root ganglion neurons of different size ［J］. J Physiol, 1992, 445:639-658.

    ［7］ Gordon R, Alexandru B, Florentina P. A cold and mentholactivated current in rat dorsal root ganglion neurons: properties and role in cold transduction ［J］. J Physiol, 2002,545:595-614.

    ［8］ Carolina R, Carlos B, Félix V. Cold sensitivity in axotomized fibers of experimental neuromas in mice ［J］. Pain, 2006,120:24-35.