Arg9/人抗HBsAg单链抗体/ EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析

【关键词】  肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9

    【Abstract】 AIM: To construct R9/ScFv14/EGFP fusion genes and to analyze the binding activity of the fusion proteins after they were expressed in E.coli BL21. METHODS: A series of oligonucleotide primers were designed and used to amplify the genes of ScFv14 and R9/ScFv14. The PCR products were cloned into pMD18T vector, followed by DNA sequencing. R9/ScFv14 gene and ScFv14 gene were ligated with EGFP gene respectively before they were recombined into the expression vector pET32a. After induced in E.coli BL21 by IPTG, the expressed fusion proteins named R9/ScFv14/EGFP and ScFv14/EGFP were detected by SDSPAGE and the binding activity of them were analyzed by indirect ELISA. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that the two fusion genes were correctly constructed. SDSPAGE analysis showed that they were successfully expressed in E.coli  BL21 and the percentages of them were 20% and 25% of total bacteria proteins respectively. Indirect ELISA confirmed that the expressed products had antigen specific binding activity. CONCLUSION: The two fusion genes were constructed successfully. And the products of them expressed in E.coli BL21 maintained the binding activity to HBsAg.

    【Keywords】 hepatitis B;  hepatitis B surface antigens;  ScFv;  Arg9

    【摘要】  目的： 构建带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，将其转化入大肠杆菌中进行表达，并分析表达产物与HBsAg的结合活性.  方法： 设计引物，将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5′端，PCR扩增后获得带有Arg9编码序列的ScFv14基因，将PCR产物连入pMD18T载体，进行序列测定. 将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分别与EGFP基因连接后转化入原核表达载体pET32a，获得ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP两种融合基因的表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS，以IPTG诱导表达，对表达产物进行SDSPAGE分析，并用间接ELISA方法检测其与HBsAg的亲和活性.  结果： 经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和R9/ScFv14/EGFP融合基因序列完全正确.SDSPAGE分析表明两种融合基因在大肠杆菌BL21中成功获得表达，表达量分别占菌体总蛋白的20% 和25%.间接ELISA检测证实所表达的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有HBsAg结合活性.  结论： 成功构建了带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，并在大肠杆菌BL21中成功表达，表达产物ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP均具有与抗原HBsAg特异性结合的活性.

    【关键词】 肝炎，乙型；肝炎表面抗原，乙型；ScFv；Arg9

    0引言

    单链抗体（ScFv）是抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过一段连接肽(linker)连接而成的一种小分子抗体.其分子质量仅为完整抗体的1/6，不仅能较好地保持抗原结合能力，并且具有分子质量小、穿透力强、半衰期短、免疫原性低、制备流程简单等特点，更有利于体内应用［1-3］. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,  GFP) 是从水母中分离出来的一种发光蛋白,可在A450 nm～490 nm的蓝光激发下发出绿色荧光，使用普通荧光显微镜即可进行观察.是近年来细胞生物领域中应用最为广泛的标记性蛋白质之一.EGFP为一种突变型GFP，所产生的荧光比野生型GFP增强，可作为标签用于检测目的蛋白及指示目的蛋白的定位. ScFv与效应分子组成的融合蛋白能否高效地内化入细胞对于其生物学功能的发挥具有非常关键的作用. Arg9是一个九聚精氨酸的短肽序列，是蛋白转膜结构域（PTDs）的一种，它能够将与之融合的蛋白携带入细胞内［4］. 我们将抗HBsAg的单链抗体（ScFv14）基因［5］与EGFP基因融合，并将Arg9编码序列融合到ScFv14/EGFP基因的5′端，构建带有转膜结构域Arg9的R9/ScFv14/EGFP融合蛋白基因，将它们在大肠杆菌中进行诱导表达，并对表达产物的亲和活性进行了分析.

    1材料和方法

    1.1材料含有编码人抗HBsAg单链抗体ScFv14基因的载体pUC19ScFv14、大肠杆菌E.coli.DH5α株和原核表达载体pET32a（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室构建［5］并保存）；EGFP融合蛋白表达载体pEGFPN3（Clontech公司）；DNA Marker, T4 DNA Ligase, pMD18T vector和限制性内切酶BamHⅠ, EcoRⅠ, NotⅠ（TaKaRa公司）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海华舜公司）；Werstern blot 显影液（Pierce公司）.

    1.2方法

    1.2.1引物的设计与合成根据ScFv14基因序列，设计引物扩增ScFv14基因，并设计引物将Arg9的编码序列引入ScFv14基因的5′端，引物序列如下：

    14F  5′  TTTGAATTCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3′；14R9F  5′ TTTGAATTCATGAGACGCAGGAGACG

    CAGGCGGAGACGGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3′； L3  5′ TTTGGATCCTCGATTGATTTCCACCTTGGT 3′. 其中划线部分为九聚精氨酸的编码序列.

    1.2.2重组质粒的构建与鉴定以pUC19ScFv14为模板，分别以14F，L3和14R9F，L3为引物扩增ScFv14基因和R9/ScFv14基因.反应条件：95℃ 35 s， 55℃ 45 s，72℃ 1 min，共进行25个循环.产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收. 回收产物分别连入pMD18T载体,转化E.coli.DH5α宿主菌，挑取单克隆,提取质粒进行酶切鉴定，阳性克隆命名为pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14，送北京三博远志生物技术公司测序.将测序正确的pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切，得到ScFv14和R9/ScFv14基因片段，将pEGFPN3用BamHⅠ和NotⅠ酶切，得到EGFP基因片段.分别将ScFv14和R9/ScFv14基因与EGFP基因在16℃条件下连接4 h后，再连入经EcoRⅠ和NotⅠ酶切的表达载体pET32a中，转化E.coli.DH5α后，筛选阳性克隆酶切鉴定.鉴定正确的质粒分别命名为pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP.

    1.2.3融合基因的诱导表达及鉴定将pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP质粒分别转化入E .coli.BL21，挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，220 r/min，  37℃培养过夜，次日以1∶100转接，在220 r/min, 37℃条件下振荡培养至A600 nm=0.4～0.6,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导培养3 h，取1 mL诱导菌液离心，收集菌体，进行SDSPAGE分析.另取5 mL诱导菌液离心，收集菌体，以0.2 mol/L的TrisHCl(pH=8.0)重悬，超声裂解后，离心取上清，沉淀用0.2 mol/L TrisHCl(pH=7.4)重悬，取上清和沉淀进行SDSPAGE分析.

    1.2.4重组融合蛋白的Western blot分析将诱导菌进行SDSPAGE 分离蛋白质，用半干式电转仪将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC）上，经50 g/L的脱脂奶粉封闭1 h，用鼠抗EGFP mAb（1∶1000稀释），4℃孵育过夜，用TBST洗膜6次，每次5 min,再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h, 用TBST洗膜6次，每次5 min,按显影液说明加入显影液，用化学发光法进行检测.

    1.2.5融合蛋白亲和活性的ELISA检测用5 mg/L HBsAg包被ELISA板,每孔100 μL, 4℃过夜. 加入不同稀释度的细菌裂解上清,每孔100 μL, 37℃孵育1 h. 设空白和阴性对照. 洗涤后,加入鼠抗EGFP mAb（1∶1000稀释）,37℃孵育1 h. 洗涤后再加入辣根过氧化酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG, 37℃孵育1 h. 最后各孔加入新鲜配制的ABTS显色液100 μL,  37℃孵育30 min,终止反应.以酶标仪测定各孔A410 nm值.