蛋白酶体抑制剂MG132对PC12细胞的增殖抑制作用

               作者：蔡同建，陈景元，李妍，季爱玲，杜可军，骆文静  

【关键词】  蛋白酶体抑制剂；PC12细胞；帕金森病；细胞凋亡

    【Abstract】 AIM: To investigate the effect of proteasome inhibitor MG132 on the proliferation and apoptosis of dopaminergic PC12 cells. METHODS: PC12 cells were treated with MG132 at different concentrations for 3 d. The effect of MG132 on the proliferation of PC12 cells was analyzed through MTT assay and the effect of MG132 on the apoptosis of PC12 cells was analyzed through Giemsa staining and flow cytometry. RESULTS: Treated for a same period （3 d）, the inhibitory effect of MG132 on PC12 cell proliferation enhanced with the increment of the concentration of MG132（0, 1, 2.5, 5, 10, 20 μmol/L）. The inhibitory rate exceeded 40% when the MG132 concentration was 2.5 μmol/L, and the 50% inhibiting concentration （IC50）was 3.78 μmol/L. MG132 also induced the apoptosis of PC12 cells obviously. The apoptosis index of the cells treated by MG132 at 2.5 μmol/L for 3 d was 24.7% examined by Giemsa staining and 25.6% by flow cytometry, that of the control cells was 1.3% and 0% respectively.  CONCLUSION: MG132 can inhibit the proliferation of dopaminergic PC12 cells and lead to apoptosis. The disfunction of proteasome may do harm to the existence of dopaminergic cells.

    【Keywords】 proteasome inhibitor; PC12 cells; Parkinson disease; apoptosis

    【摘要】 目的： 了解蛋白酶体抑制剂MG132对多巴胺能细胞PC12增殖和凋亡的影响. 方法： 用不同浓度的MG132处理PC12细胞3 d，通过3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐（MTT）微量比色法检测MG132对PC12细胞增殖的影响，通过姬姆萨染色法和流式细胞术检测MG132对PC12细胞凋亡的影响. 结果： 在作用时间相同（3 d）的条件下，随着MG132浓度的增高（0， 1， 2.5， 5， 10， 20 μmol/L），对PC12细胞增殖的抑制作用逐渐增强. 当MG132浓度达到2.5 μmol/L时，对PC12细胞的抑制率超过40%, IC50＝3.78 μmol/L. 同时，MG132能够明显诱导PC12细胞凋亡： 姬姆萨染色显示，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d，细胞凋亡率为24.7%，而对照为1.3%；流式细胞术分析结果表明，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d，细胞凋亡率为25.6%，而对照为0%. 结论： 蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制多巴胺能细胞PC12的增殖并诱导细胞凋亡，蛋白酶体活性的丧失可能影响到多巴胺能细胞的生存.

    【关键词】 蛋白酶体抑制剂；PC12细胞；帕金森病；细胞凋亡

     0引言

    帕金森病（parkinsons disease, PD）是最常见的神经系统退行性疾病之一，严重危害患者身体健康和降低患者的生活质量［1-2］. PD的病因和发病机制至今不够明确. 越来越多的证据表明，多巴胺能神经元内蛋白质的损伤和功能异常蛋白的蓄积在散发性PD的发病过程中起着重要的作用［3］. 蛋白酶体是一种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解酶，在泛素蛋白酶体通路（ubiquitinproteasome pathway, UPS）中起催化作用［4-5］. 本研究以多巴胺能细胞PC12为研究对象，观察蛋白酶体抑制剂MG132对PC12细胞的增殖和凋亡的影响，以探讨蛋白酶体活性异常在PD发病过程中的作用，为阐明PD的发病机理提供新的实验依据.

    1材料和方法

    1.1材料高分化型PC12细胞购于院上海细胞所；新生牛血清（奥地利PAA公司）；DMEM培养基干粉（美国Gibco公司）；MTT、MG132（美国Sigma公司）；6 孔培养板（丹麦NUNC公司）；NU2500E型CO2 孵箱（英国Forma Scientif公司）；酶联免疫检测仪（江苏国营华东管厂）.

    1.2方法

    1.2.1PC12细胞的培养与传代细胞在加入100 mL/L小牛血清,100 U/mL青霉素的DMEM培养液中，37℃, 50 mL/L CO2常规培养. 待细胞长满至培养瓶底面积80%之后传代.

    1.2.2细胞毒性试验（MTT法）取对数生长期的细胞，接种于96孔板中. 第2日换含有MG132 0, 1, 2.5, 5, 10和20 μmol/L的培养液，继续培养3 d，加入MTT（5 g/L, 20 μL/孔），继续培养4 h，终止培养，小心吸弃培养孔内上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡摇匀，使MTT产生的蓝色结晶充分溶解，在酶标仪上以波长490 nm测定各孔A值. 细胞增殖抑制率按照下式进行（对照组为0剂量组，实验组为不同浓度MG132作用组）： IR（%）=（A对照组-A实验组）/A对照组×100.

    1.2.3姬姆萨染色法观察取对数生长期的细胞，常规爬片. 24 h以后，分别以正常培养液和加入MG132 2.5 μmol/L的培养液继续培养3 d，然后进行Giemsa染色. 染色方法： 0.01  mol/L PBS清洗玻片3～5次；利用卡诺固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）固定20  min；用新配制的Giemsa染色液染色20 min；自来水流水冲洗，二甲苯透明，光镜下观察染色效果，并拍照. 结果判断： 发生凋亡的细胞以及凋亡小体呈紫蓝色深染，容易在光镜下辨认. 每张盖玻片选择3个视野，每个视野计算100个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞的阳性指数.

    1.2.4流式细胞术检测将对照组和实验组（2.5 μmol/L处理3 d）的细胞分别制成单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤2次；700 mL/L的乙醇4℃固定30 min. 流式细胞术测定细胞DNA含量，进行细胞周期分析和凋亡率的比较.

    统计学处理： SPSS11.0统计软件进行统计分析. MTT实验结果用x±s表示，假设检验用方差分析，各实验组与对照组之间的比较使用Dunnettt检验；姬姆萨染色法的实验结果用u检验，以P<0.05为有统计学意义.

    2结果

    2.1MTT实验结果显示，不同浓度的MG132作用于细胞3 d后，在1～20 μmol/L浓度范围内，MG132对PC12细胞呈浓度依赖性的增殖抑制作用（IC50＝3.78 μmol/L）. 作用第3日, 2.5 μmol/L和5 μmol/L MG132对细胞的抑制率分别为43.47%和66.67%（表1）.表1不同浓度的MG132对PC12细胞增殖的抑制作用

    2.2姬姆萨染色法检测细胞凋亡浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d后，镜下观察，含有MG132的实验组细胞总数明显低于对照组. 对照组基本上难以看到凋亡细胞，而MG132实验组随处可见紫蓝色深染的凋亡细胞（图1）. 通过，对照组细胞凋亡率为1.3%，MG132实验组细胞凋亡率为24.7%. MG132实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）.

    2.3流式细胞仪检测结果显示，2.5 μmol/L蛋白酶体抑制剂MG132作用于PC12细胞3 d后，与对照组相比，S期细胞所占比例有所下降，从28.7%下降到24.6%. 对照组未见凋亡峰，而加入MG132的实验组有典型的亚二倍体凋亡峰，凋亡率为25.6%（图2）.

    3讨论

    在临床上，PD主要病理改变为黑质、纹状体多巴胺能神经元的进行性变性、死亡，导致纹状体内多巴胺浓度的明显下降［6］. 由此可见，多巴胺能神经元的增殖和凋亡的变化在PD的发病中起重要作用. PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，高分化型的PC12细胞在形态、生理、生化功能方面接近于中脑多巴胺神经元，因此在国内外常作为多巴胺神经元的细胞模型［3］. 近期的研究表明，多巴胺能神经元内异常蛋白的蓄积是PD发病的机理之一，传统的研究着重于这些异常蛋白的形成过程，很少关注其代谢和降解途径.

     蛋白酶体是一种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解酶，在UPS中起催化作用. UPS是蛋白质选择性降解的主要方式，可以清除真核细胞中突变、损伤和异常折叠的蛋白质，维持细胞内环境的稳定，在维持细胞正常功能方面发挥着重要作用［7-8］. MG132是蛋白酶体抑制剂，可以抑制UPS中起主要催化作用的蛋白酶体的催化活性，从而阻断了UPS对异常蛋白的降解. 在PD的研究过程中，人们已经发现，αsynuclein, Parkin和UCHL1等基因的突变可能与一些家族性PD的发生有关. 而这三种基因都与UPS的功能有关［9］.

    本研究结果显示，一定浓度的蛋白酶体抑制剂MG132对PC12细胞的增殖有明显的抑制作用. 在引起细胞增殖抑制的同时，MG132还诱导细胞凋亡. 姬姆萨染色和流式细胞术结果均显示，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d后，可明显诱导PC12细胞的凋亡. 通过抑制蛋白酶体的活性，直接导致了PC12细胞增殖的抑制以及凋亡率的增高. 这表明，作为维持细胞内稳态的重要物质，蛋白酶体的功能是否正常至关重要，蛋白酶体活性的改变能够对PC12细胞的生存产生重要的影响，正常的蛋白酶体活性对维持神经系统的正常功能有着重要的意义. 本实验结果再次证明，多巴胺能神经元内异常蛋白的蓄积在PD的发病过程中起着不可忽视的作用，保持多巴胺能神经元内异常蛋白的降解系统UPS功能的正常，可以为PD的预防提供一个新的思路.

    【】

    ［1］ Lieberman A. Depression in Parkinsons disease a review ［J］. Acta Neurol Scand, 2006,113（1）:1-8.

    ［2］ 黄海东，邓敬兰，陈建宗，等. 偏侧帕金森病模型猴脑黑质和纹状体的超微结构变化［J］. 第四军医大学学报，2004,25（4）:317-320.

    ［3］ 吴小军，高国栋，吕葆真，等. 神经节苷脂对PC12细胞的抗凋亡作用［J］. 第四军医大学学报，2002,23（6）:517-520.

    ［4］ Hershko A. The ubiquitin system for protein degradation and some of its roles in the control of the cell division cycle  ［J］. Cell Death Differ, 2005,12（9）:1191-1197.

    ［5］ Yano M, Kanesaki Y, Koumoto Y, et al. Chaperone activities of the 26S and 20S proteasome ［J］. Curr Protein Pept Sci, 2005,6（2）:197-203.

    ［6］ 傅求真，李柱一，井晓荣，等. 1甲基4苯基吡啶盐对多巴胺能细胞系SHSY5Y的毒性作用机制［J］. 第四军医大学学报，2003,24（16）:1520-1522.

    ［7］ Hershko A. The ubiquitin system for protein degradation and some of its roles in the control of the cell division cycle  ［J］. Cell Death Differ, 2005,12（9）:1191-1197.

    ［8］ Yano M, Kanesaki Y, Koumoto Y, et al. Chaperone activities of the 26S and 20S proteasome ［J］. Curr Protein Pept Sci, 2005,6（2）:197-203.

    ［9］ Hague SM, Klaffke S, Bandmann O. Neurodegenerative disorders: Parkinsons disease and Huntingtons disease  ［J］. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2005,76（8）:1058-1063.